摘要    磷酸化修飾是一種重要的蛋白質(zhì)化學修飾,  對蛋白質(zhì)功能的完成或改變起到重要作用,。該領(lǐng)域的研究存在很多技術(shù)難點,  對該領(lǐng)域研究形成了挑戰(zhàn),。近年來相關(guān)技術(shù)有了很多突破,  磷酸化研究也取得了很多新的成就,。文章將從磷酸化蛋白的檢出、磷酸化蛋白質(zhì)和肽段的富集,、生物質(zhì)譜技術(shù)的改進以及磷酸化蛋白和多肽的定量與比較幾個方面介紹該研究領(lǐng)域的技術(shù)進展。

關(guān)鍵詞      磷酸化蛋白      磷酸化肽      生物質(zhì)譜      定量分析

生命活動與蛋白質(zhì)的動態(tài)變化密切相關(guān),  很多情況下某些蛋白質(zhì)的絕對量并不會發(fā)生明顯變化,  而是通過各種翻譯后修飾來完成或改變其功能。在數(shù)量眾多的蛋白質(zhì)翻譯后修飾中,  磷酸化修飾是非常重要的一種,  現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的所有蛋白質(zhì)中超過30%可被磷酸化修飾,。蛋白質(zhì)的磷酸化修飾與多種生物學過程密切相關(guān),  如DNA損傷修復[1]、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[2],、信號轉(zhuǎn)導[3],、細胞凋亡的調(diào)節(jié)[4]等。磷酸化蛋白質(zhì)及多肽的研究可幫助我們闡明上述過程的機理,  進一步認識生命活動的本質(zhì),。近年來不斷出現(xiàn)的許多相關(guān)的新技術(shù),、新方法推動了該領(lǐng)域研究的進展。

1    磷酸化蛋白的檢出

當前針對蛋白的研究絕大多數(shù)是基于電泳的,  膠上磷酸化蛋白點的檢出是一個重要環(huán)節(jié),。較早期的研究中最常用的方法是用32P標記的磷酸根通過代謝進入細胞中并被利用,  使得細胞內(nèi)的磷酸化蛋白帶有放射性的32P,  從而可在電泳后被檢出[5],。該方法需要接觸大量的放射性物質(zhì),  并且只能應用于培養(yǎng)的細胞,  所以已經(jīng)逐漸被淘汰。利用抗磷酸化蛋白的抗體進行Western  blot檢測,  具有特異性好,、分辨率高的優(yōu)點,  至今還是常用的手段[6],  但由于分析和制備不能用同一塊膠,  有時檢出的蛋白點與膠上的蛋白點很難對應,  使分析變得困難,。Schulenberg  等[7]在2003年報道了一種小分子的熒光染料Pro-Q  Diamond  dye,  可對磷酸化蛋白質(zhì)特異性染色,  該方法方便、快捷且具有較高的靈敏性,  兼容質(zhì)譜鑒定,  隨后還可再進行其它方法的染色,。Martin  等[8]將一些蛋白質(zhì)和肽段列陣在幾種商業(yè)化的襯底上,  然后利用Pro-Q  Diamond  dye檢驗芯片上的蛋白質(zhì)及多肽的磷酸化水平,  靈敏度可達到312-625fg,  這種芯片與高靈敏度檢出方法的結(jié)合提供了一個強有力的研究信號通路及磷酸酶抑制物的平臺,。熒光雙向差異凝膠電泳(Fluorescent  two  dimensional  difference  gel  electrophoresis,  2D-DIGE)是近幾年出現(xiàn)的一種基于雙向電泳的熒光標記蛋白質(zhì)差異比較的技術(shù),  具有非常好的檢出靈敏度,  并且由于所要比較的目的蛋白始終在相同的條件進行一向、二向電泳并展示在同一張膠上,  從而減少了實驗誤差引起的差異,  該技術(shù)已經(jīng)成為比較蛋白質(zhì)組研究的有力工具。磷酸化蛋白質(zhì)只是某個蛋白質(zhì)組中的一小部分,  DIGE技術(shù)不能對其特異性標記,  所以利用DIGE技術(shù)對磷酸化蛋白的比較分析是困難的,。Seisuke  等[9]很好的解決了這一問題,  他們在實驗中利用磷酸化蛋白富集試劑盒富集磷酸化蛋白后,  利用DIGE技術(shù)進行差異分析,  擴展了DIGE技術(shù)的應用范圍,。

2    磷酸化蛋白質(zhì)、肽段的富集

由于磷酸化肽段相對于非磷酸化肽段來說是非常少的,  在質(zhì)譜鑒定時易被其它肽段掩蓋,  所以常常需要對磷酸化蛋白質(zhì)或肽段富集后再進行鑒定,。用于富集磷酸化蛋白質(zhì),、肽段的經(jīng)典方法有金屬離子親和層析(IMAC)[10]、生物素―親和素富集[11],、免疫沉淀[12]和磷酸化抗體親和層析[13]等方法,。上述方法大多是基于層析技術(shù),  而層析柱填料的性質(zhì)則是影響富集效果的關(guān)鍵因素。2004年,  Pinkse等[14]利用TiO2填料自制層析柱,  將自磷酸化蛋白PKG酶切產(chǎn)物用此柱分離后進行在線ESI-MS/MS分析,  鑒定出PKG至少有8個磷酸化位點,  并發(fā)現(xiàn)Ser-26  和  Ser-44兩個新的磷酸化位點,。Pinkse等認為TiO2填料可與磷酸化肽段高效,、特異的結(jié)合,  從而有效富集磷酸化肽段,  應用前景很好。利用反相柱脫鹽,、濃縮肽段之后進行質(zhì)譜鑒定是比較常用的肽段鑒定方法,  但對于親水肽段,  比如磷酸化后變?yōu)橛H水的磷酸化肽段鑒定效果不好,。Larsen等[15]比較反相樹脂與石墨填料柱對磷酸化肽段的分離效果,  認為后者可有效的滯留磷酸化肽段,  更適合磷酸化肽段的富集、分離和鑒定,。對于磷酸化肽段的富集,  一些學者并沒有將目光僅僅局限在親和填料的改進上,  Steven等[16]發(fā)現(xiàn)在pH2.7左右大部分胰蛋白酶酶切肽段帶有兩個正電荷,  而肽段上有一個磷酸化修飾時則帶有一個正電荷,  根據(jù)這一現(xiàn)象,  可利用強陽離子交換色譜將帶有一個正電荷的磷酸化肽段富集,。Steven等利用這一方法在Hela細胞核中鑒定出967個蛋白中的2  002個磷酸化位點,  得到了現(xiàn)今為止最大的磷酸化蛋白譜。

3    利用生物質(zhì)譜確認磷酸化位點

利用一級質(zhì)譜結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜可確定磷酸化位點,。例如通過MALDI-TOF/TOF一級質(zhì)譜可發(fā)現(xiàn)與肽段分子量理論值相差80  Da  (HPO3=80  Da)  的質(zhì)譜峰,  該峰的二級質(zhì)譜圖中如果母離子與旁邊的最高強度的質(zhì)譜峰相差98  Da  (中性丟失H3PO4=98  Da),  則可確定該肽段為磷酸化肽段(圖1),  進一步通過二級或多級質(zhì)譜的譜圖確認具體的磷酸化位點,。此外,  利用β－消除反應使絲氨酸、蘇氨酸磷酸化殘基轉(zhuǎn)化為氨乙基丙氨酸,  后者為賴氨酸的同形物,  此位點可被胰蛋白酶和Lys-C  肽鏈內(nèi)切酶等酶特異性識別,、酶切,  通過質(zhì)譜即可很容易地判斷磷酸化位點,。所以磷酸化位點的確認有賴于簡化的質(zhì)譜譜圖和串聯(lián)質(zhì)譜的應用以及質(zhì)譜檢測靈敏度的提高。近年來生物質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展為蛋白質(zhì)磷酸化位點的檢測提供了更多可選擇的儀器和方法,。