摘要    磷酸化修飾是一種重要的蛋白質(zhì)化學(xué)修飾,  對(duì)蛋白質(zhì)功能的完成或改變起到重要作用,。該領(lǐng)域的研究存在很多技術(shù)難點(diǎn),  對(duì)該領(lǐng)域研究形成了挑戰(zhàn)。近年來(lái)相關(guān)技術(shù)有了很多突破,  磷酸化研究也取得了很多新的成就,。文章將從磷酸化蛋白的檢出,、磷酸化蛋白質(zhì)和肽段的富集、生物質(zhì)譜技術(shù)的改進(jìn)以及磷酸化蛋白和多肽的定量與比較幾個(gè)方面介紹該研究領(lǐng)域的技術(shù)進(jìn)展,。

關(guān)鍵詞      磷酸化蛋白      磷酸化肽      生物質(zhì)譜      定量分析

生命活動(dòng)與蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化密切相關(guān),  很多情況下某些蛋白質(zhì)的絕對(duì)量并不會(huì)發(fā)生明顯變化,  而是通過(guò)各種翻譯后修飾來(lái)完成或改變其功能,。在數(shù)量眾多的蛋白質(zhì)翻譯后修飾中,  磷酸化修飾是非常重要的一種,  現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的所有蛋白質(zhì)中超過(guò)30%可被磷酸化修飾。蛋白質(zhì)的磷酸化修飾與多種生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān),  如DNA損傷修復(fù)[1],、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[2],、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)[4]等,。磷酸化蛋白質(zhì)及多肽的研究可幫助我們闡明上述過(guò)程的機(jī)理,  進(jìn)一步認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)的本質(zhì),。近年來(lái)不斷出現(xiàn)的許多相關(guān)的新技術(shù)、新方法推動(dòng)了該領(lǐng)域研究的進(jìn)展,。

1    磷酸化蛋白的檢出

當(dāng)前針對(duì)蛋白的研究絕大多數(shù)是基于電泳的,  膠上磷酸化蛋白點(diǎn)的檢出是一個(gè)重要環(huán)節(jié),。較早期的研究中最常用的方法是用32P標(biāo)記的磷酸根通過(guò)代謝進(jìn)入細(xì)胞中并被利用,  使得細(xì)胞內(nèi)的磷酸化蛋白帶有放射性的32P,  從而可在電泳后被檢出[5]。該方法需要接觸大量的放射性物質(zhì),  并且只能應(yīng)用于培養(yǎng)的細(xì)胞,  所以已經(jīng)逐漸被淘汰,。利用抗磷酸化蛋白的抗體進(jìn)行Western  blot檢測(cè),  具有特異性好,、分辨率高的優(yōu)點(diǎn),  至今還是常用的手段[6],  但由于分析和制備不能用同一塊膠,  有時(shí)檢出的蛋白點(diǎn)與膠上的蛋白點(diǎn)很難對(duì)應(yīng),  使分析變得困難。Schulenberg  等[7]在2003年報(bào)道了一種小分子的熒光染料Pro-Q  Diamond  dye,  可對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)特異性染色,  該方法方便,、快捷且具有較高的靈敏性,  兼容質(zhì)譜鑒定,  隨后還可再進(jìn)行其它方法的染色,。Martin  等[8]將一些蛋白質(zhì)和肽段列陣在幾種商業(yè)化的襯底上,  然后利用Pro-Q  Diamond  dye檢驗(yàn)芯片上的蛋白質(zhì)及多肽的磷酸化水平,  靈敏度可達(dá)到312-625fg,  這種芯片與高靈敏度檢出方法的結(jié)合提供了一個(gè)強(qiáng)有力的研究信號(hào)通路及磷酸酶抑制物的平臺(tái)。熒光雙向差異凝膠電泳(Fluorescent  two  dimensional  difference  gel  electrophoresis,  2D-DIGE)是近幾年出現(xiàn)的一種基于雙向電泳的熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)差異比較的技術(shù),  具有非常好的檢出靈敏度,  并且由于所要比較的目的蛋白始終在相同的條件進(jìn)行一向,、二向電泳并展示在同一張膠上,  從而減少了實(shí)驗(yàn)誤差引起的差異,  該技術(shù)已經(jīng)成為比較蛋白質(zhì)組研究的有力工具,。磷酸化蛋白質(zhì)只是某個(gè)蛋白質(zhì)組中的一小部分,  DIGE技術(shù)不能對(duì)其特異性標(biāo)記,  所以利用DIGE技術(shù)對(duì)磷酸化蛋白的比較分析是困難的。Seisuke  等[9]很好的解決了這一問(wèn)題,  他們?cè)趯?shí)驗(yàn)中利用磷酸化蛋白富集試劑盒富集磷酸化蛋白后,  利用DIGE技術(shù)進(jìn)行差異分析,  擴(kuò)展了DIGE技術(shù)的應(yīng)用范圍,。

2    磷酸化蛋白質(zhì),、肽段的富集

由于磷酸化肽段相對(duì)于非磷酸化肽段來(lái)說(shuō)是非常少的,  在質(zhì)譜鑒定時(shí)易被其它肽段掩蓋,  所以常常需要對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)或肽段富集后再進(jìn)行鑒定。用于富集磷酸化蛋白質(zhì),、肽段的經(jīng)典方法有金屬離子親和層析(IMAC)[10],、生物素―親和素富集[11]、免疫沉淀[12]和磷酸化抗體親和層析[13]等方法,。上述方法大多是基于層析技術(shù),  而層析柱填料的性質(zhì)則是影響富集效果的關(guān)鍵因素,。2004年,  Pinkse等[14]利用TiO2填料自制層析柱,  將自磷酸化蛋白PKG酶切產(chǎn)物用此柱分離后進(jìn)行在線ESI-MS/MS分析,  鑒定出PKG至少有8個(gè)磷酸化位點(diǎn),  并發(fā)現(xiàn)Ser-26  和  Ser-44兩個(gè)新的磷酸化位點(diǎn)。Pinkse等認(rèn)為TiO2填料可與磷酸化肽段高效,、特異的結(jié)合,  從而有效富集磷酸化肽段,  應(yīng)用前景很好,。利用反相柱脫鹽、濃縮肽段之后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定是比較常用的肽段鑒定方法,  但對(duì)于親水肽段,  比如磷酸化后變?yōu)橛H水的磷酸化肽段鑒定效果不好,。Larsen等[15]比較反相樹(shù)脂與石墨填料柱對(duì)磷酸化肽段的分離效果,  認(rèn)為后者可有效的滯留磷酸化肽段,  更適合磷酸化肽段的富集,、分離和鑒定。對(duì)于磷酸化肽段的富集,  一些學(xué)者并沒(méi)有將目光僅僅局限在親和填料的改進(jìn)上,  Steven等[16]發(fā)現(xiàn)在pH2.7左右大部分胰蛋白酶酶切肽段帶有兩個(gè)正電荷,  而肽段上有一個(gè)磷酸化修飾時(shí)則帶有一個(gè)正電荷,  根據(jù)這一現(xiàn)象,  可利用強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜將帶有一個(gè)正電荷的磷酸化肽段富集,。Steven等利用這一方法在Hela細(xì)胞核中鑒定出967個(gè)蛋白中的2  002個(gè)磷酸化位點(diǎn),  得到了現(xiàn)今為止最大的磷酸化蛋白譜,。

3    利用生物質(zhì)譜確認(rèn)磷酸化位點(diǎn)

利用一級(jí)質(zhì)譜結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜可確定磷酸化位點(diǎn)。例如通過(guò)MALDI-TOF/TOF一級(jí)質(zhì)譜可發(fā)現(xiàn)與肽段分子量理論值相差80  Da  (HPO3=80  Da)  的質(zhì)譜峰,  該峰的二級(jí)質(zhì)譜圖中如果母離子與旁邊的最高強(qiáng)度的質(zhì)譜峰相差98  Da  (中性丟失H3PO4=98  Da),  則可確定該肽段為磷酸化肽段(圖1),  進(jìn)一步通過(guò)二級(jí)或多級(jí)質(zhì)譜的譜圖確認(rèn)具體的磷酸化位點(diǎn),。此外,  利用β－消除反應(yīng)使絲氨酸,、蘇氨酸磷酸化殘基轉(zhuǎn)化為氨乙基丙氨酸,  后者為賴氨酸的同形物,  此位點(diǎn)可被胰蛋白酶和Lys-C  肽鏈內(nèi)切酶等酶特異性識(shí)別、酶切,  通過(guò)質(zhì)譜即可很容易地判斷磷酸化位點(diǎn),。所以磷酸化位點(diǎn)的確認(rèn)有賴于簡(jiǎn)化的質(zhì)譜譜圖和串聯(lián)質(zhì)譜的應(yīng)用以及質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度的提高,。近年來(lái)生物質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展為蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)的檢測(cè)提供了更多可選擇的儀器和方法。