摘要：DNA疫苗又稱為核酸疫苗,，是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來(lái)的一種全新疫苗,，具有能夠激發(fā)機(jī)體體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，核酸疫苗因高效,、持久,、廣譜、簡(jiǎn)便,、廉價(jià),、無(wú)致病性等特點(diǎn)，被作為一種新型的疫苗而得到廣泛的研究和應(yīng)用,，是近年來(lái)研究的一個(gè)熱點(diǎn),。抗原編碼基因的選擇,、質(zhì)粒的構(gòu)建,、各種佐劑的應(yīng)用以及疫苗接種方法和途徑等因素可以提高和改變DNA疫苗的免疫效果與反應(yīng)類型。DNA疫苗不僅有預(yù)防疾病的作用,，同時(shí)還具有治療疾病的作用,。在不久的將來(lái)，DNA疫苗有望成為人類防治疾病的重要手段。
關(guān)鍵詞：DNA疫苗,；抗原基因,；免疫機(jī)制
DNA疫苗是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的新型疫苗，是繼減毒疫苗,、基因工程疫苗之后的第3代疫苗,。DNA疫苗(DNAvaccine)是由插入一種或多種外源基因的質(zhì)粒DNA(來(lái)自細(xì)菌)和真核啟動(dòng)調(diào)控基因等元件構(gòu)成的，載有外源抗原的質(zhì)粒DNA在一種真核啟動(dòng)子和加尾信號(hào)以及相關(guān)增強(qiáng)子等基因單元的控制下,，可在哺乳動(dòng)物的各類細(xì)胞中表達(dá)出相關(guān)的抗原蛋白[1],。將重組有外源抗原編碼基因的質(zhì)粒，利用某種方法直接導(dǎo)入人或動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi),，通過(guò)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng),，在被免疫對(duì)象機(jī)體的活體細(xì)胞合成抗原蛋白，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,。
1DNA疫苗的組成
DNA疫苗由病原抗原編碼基因及質(zhì)粒載體兩部分組成,。抗原基因可以是單個(gè)基因或完整的一組基因,，也可以是編碼抗原決定簇的一段核苷酸序列,。DNA疫苗載體質(zhì)粒一般以質(zhì)粒為基本骨架。常用的質(zhì)粒載體有pSV2,、pRSV,、pcDNA3.1、pCI和pVAX1等,。這些源于大腸埃希菌的質(zhì)粒載體可在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因,，理論上，它們的結(jié)構(gòu)包括兩種不同的單元促使抗原合成的轉(zhuǎn)錄復(fù)合單元,，一套用于表達(dá)大腸埃希菌,，另一套用于在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。它含有一啟動(dòng)子/增強(qiáng)子,，帶有功能性剪接供體和受體位點(diǎn)的內(nèi)含子,，編碼抗原蛋白的基因序列以及多聚polyA加尾信號(hào)，啟動(dòng)子多采用CMV,、SV40,、RSV、LTR及肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子序列,，它們都具有較高的轉(zhuǎn)錄活性,，在多種動(dòng)物細(xì)胞中能高效表達(dá),；原核細(xì)胞元件,，如復(fù)制起點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)以及有利于重組載體的構(gòu)建并可加速其在細(xì)菌中增殖和擴(kuò)增的選擇標(biāo)志，且質(zhì)粒的基本骨架中還有促T細(xì)胞激活的免疫刺激序列(ISS)[2-3],。
2CpG免疫刺激的作用
DNA疫苗中具有免疫刺激活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是非甲基化的CpG基序(CpGmotif),，又稱為免疫刺激序列(immunostimulatorysequences，ISS),。
目前,，寡核苷酸免疫刺激機(jī)理尚不清楚。含有CpG序列的寡核苷酸可刺激鼠B細(xì)胞增生和免疫球蛋白的產(chǎn)生,，并可在體內(nèi)及體外誘導(dǎo)T,、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞分泌某些細(xì)胞因子，如IL-6,、IL-12和IFN-γ,。寡核苷酸的免疫調(diào)節(jié)作用與序列結(jié)構(gòu)有關(guān)，一般認(rèn)為B細(xì)胞有效的活化須具有5′端兩個(gè)嘌呤,、3′端兩個(gè)嘧啶的CpG基序,，能夠序列特異性和非序列特異性地結(jié)合血清中的病毒和細(xì)胞蛋白，并非特異性地激活轉(zhuǎn)錄因子Spl[4],。CpG基序可誘生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞,，這可能是因B細(xì)胞的活化促進(jìn)了共刺激分子(CD86和CD25)的表達(dá)，或因CpG基序改變了T細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞受體活化信號(hào)的敏感性而造成,。Sato等發(fā)現(xiàn),，將β-半乳糖苷酶(β-Gal)基因整合入含卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒后，表達(dá)β-Gal的水平比整合到含氨芐抗性基因的質(zhì)粒要高,，但誘導(dǎo)的抗β-Gal的抗體水平則相反,。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，氨芐抗性基因中含有兩個(gè)重復(fù)的未甲基化的AACGT序列,，而卡那霉素抗性基因則沒(méi)有,。將此序列插入含卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒載體中可提高誘生抗β-Gal的抗體水平，并有效地誘導(dǎo)產(chǎn)生了較高的IgG,、CTLs和IFN-γ,。AACGT是已經(jīng)證實(shí)了的具有免疫刺激活性的CpG基序，因此人們?cè)O(shè)想可以把DNA疫苗結(jié)構(gòu)分為編碼抗原區(qū)和骨架區(qū),，期望可以通過(guò)增加骨架結(jié)構(gòu)中的免疫刺激CpG基序提高疫苗的免疫效果,，但還需更多研究[5-7]。
研究發(fā)現(xiàn)CpG基序常以PuPuCpGPyPy的形式出現(xiàn)于細(xì)菌基因組DNA序列和質(zhì)粒中,，出現(xiàn)頻率為1/16,；而脊椎動(dòng)物中較少，出現(xiàn)頻率為1/50,。原核細(xì)胞CpG中的胞苷酸的甲基化不足5%,，而真核則達(dá)70%～90%。對(duì)于脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，能夠識(shí)別原核生物DNA中以未甲基化的CpG為核心的CpG序列,，產(chǎn)生免疫激發(fā),，而且針對(duì)CpG兩側(cè)不同的脫氧核苷酸順序分泌不同種類的細(xì)胞因子。
3DNA疫苗的免疫應(yīng)答機(jī)制
DNA質(zhì)粒被導(dǎo)入宿主細(xì)胞后,，病原體抗原的基因片段在宿主細(xì)胞內(nèi)得到表達(dá)并合成抗原,，再經(jīng)過(guò)加工、處理,、修飾遞呈給免疫系統(tǒng),，激發(fā)免疫應(yīng)答。這一過(guò)程類似于病原微生物感染或減毒活疫苗接種,，所以DNA疫苗能有效地激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫,，尤其是其具有激活殺傷性T淋巴細(xì)胞的作用。
3.1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)
3.1.1MHCⅠ途徑DNA疫苗接種機(jī)體后,，質(zhì)粒被周圍細(xì)胞攝取并被細(xì)胞質(zhì)中的酶復(fù)合物-蛋白酶體所降解,，形成9個(gè)～13個(gè)氨基酸的肽段，然后經(jīng)抗原轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TAP)轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔進(jìn)一步修飾成8個(gè)～10個(gè)氨基酸的短肽,。這些短肽(抗原表位)片段在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔與新合成的MHCⅠ分子的抗原結(jié)合槽相結(jié)合,，形成抗原肽-MHCⅠ分子復(fù)合物，并經(jīng)高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面作為免疫原信號(hào)供CD8＋CTL所識(shí)別,，導(dǎo)致其活化,、增殖并分化為具有殺傷能力的效應(yīng)CTL(Tc)，誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)[3,9],。這些效應(yīng)Tc細(xì)胞可以類似于NK細(xì)胞的機(jī)制,，通過(guò)釋放穿孔素和顆粒酶殺死病毒感染的細(xì)胞，使其發(fā)生溶解從而限制病毒感染的擴(kuò)散,。此外,，效應(yīng)CTL還可通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞因子等非溶細(xì)胞機(jī)制來(lái)抑制病毒。
目前認(rèn)為,，DNA導(dǎo)入皮膚后,，由于肌細(xì)胞是不可再分裂的細(xì)胞，因此質(zhì)?？稍诩〖?xì)胞中長(zhǎng)時(shí)間保留從而使外源DNA得以長(zhǎng)期的表達(dá),。此外，由于肌細(xì)胞幾乎包括所有類型的細(xì)胞,，如專職抗原遞呈細(xì)胞(朗罕氏細(xì)胞,、樹突細(xì)胞)等，因此肌細(xì)胞都可以攝取和表達(dá)抗原,，或接受鄰近其他細(xì)胞遞呈的抗原,，再遞呈給組織內(nèi)同樣較豐富的Th和CTL細(xì)胞[10],，或鄰近的淋巴組織。這可能也是皮膚導(dǎo)入途徑通常只需要極少量外源DNA的原因,。但是肌細(xì)胞MHCⅠ分子的低表達(dá)使人們對(duì)其抗原遞呈的能力表示懷疑,。Ulmer等利用體外轉(zhuǎn)染的方式將含有抗原基因的成肌細(xì)胞移植于同系小鼠的肌肉內(nèi)后發(fā)現(xiàn)其能夠有效激活CTL活性,，并誘導(dǎo)產(chǎn)生了相應(yīng)抗體,；同時(shí)，他將此H-2k背景的成肌細(xì)胞接種到H-2d×H-2k雜交一代小鼠發(fā)現(xiàn)：激活的CTL不僅具有H-2k限制性識(shí)別,，同時(shí)也具有H-2d的限制性識(shí)別,。因而，他認(rèn)為肌細(xì)胞表達(dá)抗原足以激活機(jī)體產(chǎn)生有效免疫,，同時(shí)鄰近的肌細(xì)胞亦可以獲得其傳遞的抗原并進(jìn)行遞呈,，從而激活機(jī)體的免疫應(yīng)答。進(jìn)一步的試驗(yàn)證明髓源的抗原遞呈細(xì)胞(APC)亦參與特異性CTL的誘導(dǎo),，且效率高于肌細(xì)胞,。
在骨髓重構(gòu)試驗(yàn)中，注射F1-骨髓重構(gòu)鼠中的親本細(xì)胞在單倍型體細(xì)胞和骨髓源細(xì)胞間產(chǎn)生錯(cuò)配,；DNA接種后的免疫反應(yīng)對(duì)重構(gòu)骨髓的單倍型有嚴(yán)格的限制,。這些結(jié)果清楚說(shuō)明骨髓源性細(xì)胞在DNA接種后的免疫反應(yīng)激活中起著非常關(guān)鍵的作用
髓源性的APC(如樹突狀細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等)可以通過(guò)兩條途徑參與抗原遞呈：①經(jīng)肌肉注射的質(zhì)粒DNA直接被周圍的APC(包括局部的組織細(xì)胞,、專職APC或其他有核細(xì)胞)攝取,，使質(zhì)粒攜帶的抗原基因得以在APC內(nèi)表達(dá)，經(jīng)加工處理后進(jìn)人MHCⅠ類分子限制性的抗原遞呈途徑,；②質(zhì)粒DNA經(jīng)肌細(xì)胞攝取后,，在其內(nèi)加工合成的抗原通過(guò)某種方式傳遞給APC，而后再進(jìn)入MHCⅠ類分子的抗原遞呈途徑[14],。
3.1.2MHCⅡ途徑MHCⅡ類分子的α與β鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與Ii鏈(invariantchain)非共價(jià)結(jié)合,，Ii鏈與MHCⅡ分子的抗原結(jié)合部位的結(jié)合有效阻止了胞質(zhì)中未成熟的內(nèi)源性抗原與MHCⅡ類分子的結(jié)合。Ii與MHCⅡ類分子結(jié)合形成的復(fù)合體經(jīng)高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)體(endsome),，在某些蛋白水解酶和低pH條件下Ii鏈與MHCⅡ類分子發(fā)生解離,。外源蛋白降解成至少含13個(gè)氨基酸的肽段，通常為17個(gè)氨基酸,。這些短肽片段(抗原表位)再與MHCⅡ類分子結(jié)合,，形成抗原肽-MHCⅡ類分子復(fù)合物，被遞呈至抗原遞呈細(xì)胞表面,，為輔助T淋巴細(xì)胞(Th細(xì)胞)所識(shí)別,，導(dǎo)致Th細(xì)胞活化、增殖,、分化為效應(yīng)Th細(xì)胞,，并分泌一系列的細(xì)胞因子(IL-2,、IL-4、IL-2,、TNF等),，從而發(fā)揮Th細(xì)胞的輔助效應(yīng)。輔助T淋巴細(xì)胞有兩類：Th1主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng),，活化巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生,；Th2主要介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞的活化及抗體的產(chǎn)生,。
3.2體液免疫
DNA疫苗激活B細(xì)胞反應(yīng)較T細(xì)胞反應(yīng)滯后,，這是因?yàn)榭贵w的產(chǎn)生有賴于完整抗原被B細(xì)胞所識(shí)別，而抗原進(jìn)入細(xì)胞表面或間隙是被B細(xì)胞識(shí)別的前提,。異源抗原被B淋巴細(xì)胞表面的免疫球蛋白所識(shí)別后,，啟動(dòng)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，被吞入的抗原分子經(jīng)水解成為免疫原性多肽,，與MHCⅡ類分子結(jié)合后表達(dá)于細(xì)胞表面,，并遞呈給CD4＋T細(xì)胞，促使其活化并分化為Th2細(xì)胞,，產(chǎn)生IL-4,、IL-5和IL-6及CD40的配體分子。在Th2型細(xì)胞因子的作用下,，B細(xì)胞活化,、增殖、分化為漿細(xì)胞,，合成并分泌抗體,，產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答。產(chǎn)生的抗體主要為IgG,，此外還有少量的IgM和IgA,。對(duì)甲型流感病毒的研究發(fā)現(xiàn)，用保守核蛋白(NP)接種小鼠所產(chǎn)生的抗血清對(duì)病毒復(fù)制無(wú)抑制作用,，而接種NP質(zhì)粒的小鼠獲得的抗血清可有效地抑制病毒復(fù)制,。可見,，基因免疫接種和抗原免疫接種所獲得的體液免疫在質(zhì)和量上存在一定差異,。
4DNA疫苗的優(yōu)點(diǎn)與安全性
DNA疫苗作為第3代疫苗，具有其自身的特點(diǎn),。
4.1DNA疫苗的優(yōu)點(diǎn)
4.1.1易操作性和穩(wěn)定性對(duì)于質(zhì)粒來(lái)說(shuō),，不管其編碼序列如何，都可用相同的方法純化和處理,，并且干燥的DNA質(zhì)粒在室溫下相對(duì)穩(wěn)定,，這一點(diǎn)決定了DNA疫苗在熱帶地區(qū)應(yīng)用的優(yōu)越性,。另外，由于其易操作性和穩(wěn)定性,，也決定了DNA疫苗生產(chǎn)成本相對(duì)低廉,，這就為DNA疫苗在發(fā)展中國(guó)家的大規(guī)模使用鋪平了道路。
4.1.2免疫效果好DNA疫苗在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá),，其加工處理過(guò)程與病毒感染的自然過(guò)程相似,，抗原遞呈過(guò)程也相同，從而以自然的形式被加工后以天然構(gòu)象遞呈給宿主的免疫識(shí)別系統(tǒng),，激發(fā)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答,。
4.1.3重組質(zhì)粒DNA在宿主體內(nèi)存在時(shí)間長(zhǎng)持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生廣泛的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答,，產(chǎn)生持久免疫,。選擇核心蛋白保守DNA序列制備基因疫苗，避免免疫逃脫現(xiàn)象,。同時(shí)DNA疫苗能刺激黏膜免疫發(fā)生,，誘導(dǎo)免疫記憶反應(yīng)[15-18]。
4.1.4DNA疫苗可用于癌癥等疑難病癥的治療研究表明,，向小鼠體內(nèi)注射編碼抗體可變區(qū)基因的質(zhì)?？僧a(chǎn)生獨(dú)特型抗體，抗體可變區(qū)基因疫苗可用于治療B淋巴瘤,。有人把編碼人癌胚抗原(CEA)的質(zhì)粒注入到小鼠舌中之后,，引起了針對(duì)CEA的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫，這一結(jié)果為治療人類結(jié)腸癌,、乳腺癌和肺癌等疾病帶來(lái)希望,。
4.1.5DNA疫苗可用于變異頻繁或血清型較多的病原免疫預(yù)防DNA疫苗在對(duì)變異頻繁或血清型較多的病原免疫預(yù)防過(guò)程中，對(duì)于目前多價(jià)活毒疫苗防治的疾病預(yù)防和治療有重要意義,。易變異的病原如流感病毒,、輪狀病毒、藍(lán)舌病病毒,、口蹄疫病毒,、雞傳染性支氣管炎病毒。
4.1.6質(zhì)粒DNA無(wú)免疫原性,，可以反復(fù)使用這一特點(diǎn)對(duì)具有母源抗體的動(dòng)物尤為重要,。
4.2DNA疫苗的安全性
DNA疫苗具有傳統(tǒng)疫苗所沒(méi)有的優(yōu)越性，但是真正運(yùn)用于人體還有許多問(wèn)題有待解決,。
載體DNA整合到宿主基因組內(nèi),，有導(dǎo)致不利轉(zhuǎn)化的可能，如通過(guò)癌基因的插入,，導(dǎo)致宿主原癌基因的插入活化或抑癌基因的失活等,，如果基因疫苗散布到生殖細(xì)胞,，并發(fā)生整合，則影響更為深遠(yuǎn)[18-22],。
免疫效果有待提高,。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物越大，基因免疫效果越差,，在小鼠試驗(yàn)中,，檢測(cè)到抗體反應(yīng)高，而到其它大型的動(dòng)物效果就不是很明顯,。
抗DNA免疫反應(yīng),。質(zhì)粒DNA會(huì)不會(huì)誘發(fā)抗雙鏈DNA的自身免疫反應(yīng)，可能引起自身免疫性疾病(系統(tǒng)性紅斑狼瘡),，正常人體中可以存在抗菌ssDNA和dsDNA抗體,，而不存在抗自身的dsDNA抗體。利用細(xì)菌DNA免疫接種,，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗哺乳動(dòng)物ssDNA抗體,，但無(wú)抗哺乳動(dòng)物dsDNA抗體的。還有DNA疫苗中含原核基因組中常見的CpG基序,，易形成抗原決定簇[21],。
5結(jié)語(yǔ)
DNA疫苗開創(chuàng)了免疫學(xué)和疫苗學(xué)的新領(lǐng)域。越來(lái)越多的試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),，DNA疫苗在免疫防御方面有良好的效果,，但DNA疫苗還面臨著許多挑戰(zhàn)，比如DNA疫苗接種的免疫學(xué)機(jī)理,，有關(guān)核酸疫苗在理論上的安全性問(wèn)題等方面,，還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)加以闡明。
現(xiàn)在普遍認(rèn)為,，DNA疫苗應(yīng)先用在傳統(tǒng)方法無(wú)法對(duì)付的病原體和疾病上,。如HIV、肺結(jié)
