摘要：DNA疫苗又稱為核酸疫苗,，是20世紀90年代初發(fā)展起來的一種全新疫苗,，具有能夠激發(fā)機體體液和細胞免疫反應，核酸疫苗因高效,、持久,、廣譜、簡便,、廉價,、無致病性等特點，被作為一種新型的疫苗而得到廣泛的研究和應用,，是近年來研究的一個熱點,。抗原編碼基因的選擇,、質粒的構建、各種佐劑的應用以及疫苗接種方法和途徑等因素可以提高和改變DNA疫苗的免疫效果與反應類型,。DNA疫苗不僅有預防疾病的作用，同時還具有治療疾病的作用,。在不久的將來，DNA疫苗有望成為人類防治疾病的重要手段,。
關鍵詞：DNA疫苗,；抗原基因,；免疫機制
DNA疫苗是20世紀90年代發(fā)展起來的新型疫苗,，是繼減毒疫苗,、基因工程疫苗之后的第3代疫苗。DNA疫苗(DNAvaccine)是由插入一種或多種外源基因的質粒DNA(來自細菌)和真核啟動調控基因等元件構成的,，載有外源抗原的質粒DNA在一種真核啟動子和加尾信號以及相關增強子等基因單元的控制下,，可在哺乳動物的各類細胞中表達出相關的抗原蛋白[1]。將重組有外源抗原編碼基因的質粒,，利用某種方法直接導入人或動物的細胞內,，通過宿主細胞的轉錄系統(tǒng),，在被免疫對象機體的活體細胞合成抗原蛋白,，從而誘導機體產生免疫應答,。
1DNA疫苗的組成
DNA疫苗由病原抗原編碼基因及質粒載體兩部分組成?？乖蚩梢允菃蝹€基因或完整的一組基因,，也可以是編碼抗原決定簇的一段核苷酸序列。DNA疫苗載體質粒一般以質粒為基本骨架,。常用的質粒載體有pSV2,、pRSV,、pcDNA3.1,、pCI和pVAX1等。這些源于大腸埃希菌的質粒載體可在真核細胞中表達外源基因,，理論上,，它們的結構包括兩種不同的單元促使抗原合成的轉錄復合單元，一套用于表達大腸埃希菌,，另一套用于在宿主細胞內表達,。它含有一啟動子/增強子，帶有功能性剪接供體和受體位點的內含子,，編碼抗原蛋白的基因序列以及多聚polyA加尾信號,，啟動子多采用CMV、SV40,、RSV、LTR及肌動蛋白啟動子序列,，它們都具有較高的轉錄活性,，在多種動物細胞中能高效表達；原核細胞元件,，如復制起點,、多克隆位點以及有利于重組載體的構建并可加速其在細菌中增殖和擴增的選擇標志，且質粒的基本骨架中還有促T細胞激活的免疫刺激序列(ISS)[2-3],。
2CpG免疫刺激的作用
DNA疫苗中具有免疫刺激活性的結構基礎是非甲基化的CpG基序(CpGmotif)，又稱為免疫刺激序列(immunostimulatorysequences,，ISS),。
目前，寡核苷酸免疫刺激機理尚不清楚,。含有CpG序列的寡核苷酸可刺激鼠B細胞增生和免疫球蛋白的產生,，并可在體內及體外誘導T,、B細胞和自然殺傷細胞分泌某些細胞因子,，如IL-6,、IL-12和IFN-γ。寡核苷酸的免疫調節(jié)作用與序列結構有關，一般認為B細胞有效的活化須具有5′端兩個嘌呤,、3′端兩個嘧啶的CpG基序,，能夠序列特異性和非序列特異性地結合血清中的病毒和細胞蛋白，并非特異性地激活轉錄因子Spl[4],。CpG基序可誘生細胞毒性T淋巴細胞,，這可能是因B細胞的活化促進了共刺激分子(CD86和CD25)的表達，或因CpG基序改變了T細胞對T細胞受體活化信號的敏感性而造成,。Sato等發(fā)現(xiàn)，將β-半乳糖苷酶(β-Gal)基因整合入含卡那霉素抗性基因的質粒后,，表達β-Gal的水平比整合到含氨芐抗性基因的質粒要高,，但誘導的抗β-Gal的抗體水平則相反。進一步研究發(fā)現(xiàn),，氨芐抗性基因中含有兩個重復的未甲基化的AACGT序列,，而卡那霉素抗性基因則沒有,。將此序列插入含卡那霉素抗性基因的質粒載體中可提高誘生抗β-Gal的抗體水平,，并有效地誘導產生了較高的IgG,、CTLs和IFN-γ,。AACGT是已經(jīng)證實了的具有免疫刺激活性的CpG基序,，因此人們設想可以把DNA疫苗結構分為編碼抗原區(qū)和骨架區(qū),，期望可以通過增加骨架結構中的免疫刺激CpG基序提高疫苗的免疫效果，但還需更多研究[5-7],。
研究發(fā)現(xiàn)CpG基序常以PuPuCpGPyPy的形式出現(xiàn)于細菌基因組DNA序列和質粒中,，出現(xiàn)頻率為1/16；而脊椎動物中較少,，出現(xiàn)頻率為1/50,。原核細胞CpG中的胞苷酸的甲基化不足5%，而真核則達70%～90%,。對于脊椎動物免疫系統(tǒng)來說，能夠識別原核生物DNA中以未甲基化的CpG為核心的CpG序列,，產生免疫激發(fā),，而且針對CpG兩側不同的脫氧核苷酸順序分泌不同種類的細胞因子。
3DNA疫苗的免疫應答機制
DNA質粒被導入宿主細胞后，病原體抗原的基因片段在宿主細胞內得到表達并合成抗原,，再經(jīng)過加工,、處理,、修飾遞呈給免疫系統(tǒng),，激發(fā)免疫應答,。這一過程類似于病原微生物感染或減毒活疫苗接種,，所以DNA疫苗能有效地激發(fā)體液免疫和細胞免疫,，尤其是其具有激活殺傷性T淋巴細胞的作用。
3.1細胞介導的免疫反應
3.1.1MHCⅠ途徑DNA疫苗接種機體后,，質粒被周圍細胞攝取并被細胞質中的酶復合物-蛋白酶體所降解,，形成9個～13個氨基酸的肽段，然后經(jīng)抗原轉運蛋白(TAP)轉運至內質網(wǎng)腔進一步修飾成8個～10個氨基酸的短肽,。這些短肽(抗原表位)片段在內質網(wǎng)腔與新合成的MHCⅠ分子的抗原結合槽相結合,，形成抗原肽-MHCⅠ分子復合物，并經(jīng)高爾基體轉運至細胞表面作為免疫原信號供CD8＋CTL所識別,，導致其活化、增殖并分化為具有殺傷能力的效應CTL(Tc),，誘導產生較強的細胞免疫反應[3,9],。這些效應Tc細胞可以類似于NK細胞的機制，通過釋放穿孔素和顆粒酶殺死病毒感染的細胞,，使其發(fā)生溶解從而限制病毒感染的擴散,。此外，效應CTL還可通過產生細胞因子等非溶細胞機制來抑制病毒,。
目前認為,，DNA導入皮膚后，由于肌細胞是不可再分裂的細胞,，因此質?？稍诩〖毎虚L時間保留從而使外源DNA得以長期的表達,。此外,，由于肌細胞幾乎包括所有類型的細胞,，如專職抗原遞呈細胞(朗罕氏細胞,、樹突細胞)等，因此肌細胞都可以攝取和表達抗原,，或接受鄰近其他細胞遞呈的抗原,，再遞呈給組織內同樣較豐富的Th和CTL細胞[10]，或鄰近的淋巴組織,。這可能也是皮膚導入途徑通常只需要極少量外源DNA的原因,。但是肌細胞MHCⅠ分子的低表達使人們對其抗原遞呈的能力表示懷疑。Ulmer等利用體外轉染的方式將含有抗原基因的成肌細胞移植于同系小鼠的肌肉內后發(fā)現(xiàn)其能夠有效激活CTL活性,，并誘導產生了相應抗體；同時,，他將此H-2k背景的成肌細胞接種到H-2d×H-2k雜交一代小鼠發(fā)現(xiàn)：激活的CTL不僅具有H-2k限制性識別,，同時也具有H-2d的限制性識別。因而,，他認為肌細胞表達抗原足以激活機體產生有效免疫,，同時鄰近的肌細胞亦可以獲得其傳遞的抗原并進行遞呈,，從而激活機體的免疫應答,。進一步的試驗證明髓源的抗原遞呈細胞(APC)亦參與特異性CTL的誘導,，且效率高于肌細胞,。
在骨髓重構試驗中,，注射F1-骨髓重構鼠中的親本細胞在單倍型體細胞和骨髓源細胞間產生錯配,；DNA接種后的免疫反應對重構骨髓的單倍型有嚴格的限制,。這些結果清楚說明骨髓源性細胞在DNA接種后的免疫反應激活中起著非常關鍵的作用
髓源性的APC(如樹突狀細胞，巨噬細胞等)可以通過兩條途徑參與抗原遞呈：①經(jīng)肌肉注射的質粒DNA直接被周圍的APC(包括局部的組織細胞,、專職APC或其他有核細胞)攝取,，使質粒攜帶的抗原基因得以在APC內表達，經(jīng)加工處理后進人MHCⅠ類分子限制性的抗原遞呈途徑,；②質粒DNA經(jīng)肌細胞攝取后，在其內加工合成的抗原通過某種方式傳遞給APC,，而后再進入MHCⅠ類分子的抗原遞呈途徑[14],。
3.1.2MHCⅡ途徑MHCⅡ類分子的α與β鏈在內質網(wǎng)中與Ii鏈(invariantchain)非共價結合，Ii鏈與MHCⅡ分子的抗原結合部位的結合有效阻止了胞質中未成熟的內源性抗原與MHCⅡ類分子的結合,。Ii與MHCⅡ類分子結合形成的復合體經(jīng)高爾基體轉運至內體(endsome),，在某些蛋白水解酶和低pH條件下Ii鏈與MHCⅡ類分子發(fā)生解離。外源蛋白降解成至少含13個氨基酸的肽段，通常為17個氨基酸,。這些短肽片段(抗原表位)再與MHCⅡ類分子結合，形成抗原肽-MHCⅡ類分子復合物,，被遞呈至抗原遞呈細胞表面,，為輔助T淋巴細胞(Th細胞)所識別，導致Th細胞活化,、增殖,、分化為效應Th細胞，并分泌一系列的細胞因子(IL-2,、IL-4、IL-2,、TNF等),，從而發(fā)揮Th細胞的輔助效應。輔助T淋巴細胞有兩類：Th1主要介導細胞免疫反應,，活化巨噬細胞的產生,；Th2主要介導體液免疫反應，誘導B淋巴細胞的活化及抗體的產生,。
3.2體液免疫
DNA疫苗激活B細胞反應較T細胞反應滯后，這是因為抗體的產生有賴于完整抗原被B細胞所識別,，而抗原進入細胞表面或間隙是被B細胞識別的前提,。異源抗原被B淋巴細胞表面的免疫球蛋白所識別后，啟動受體介導的內吞作用,，被吞入的抗原分子經(jīng)水解成為免疫原性多肽,，與MHCⅡ類分子結合后表達于細胞表面，并遞呈給CD4＋T細胞,，促使其活化并分化為Th2細胞，產生IL-4,、IL-5和IL-6及CD40的配體分子,。在Th2型細胞因子的作用下，B細胞活化,、增殖,、分化為漿細胞，合成并分泌抗體,，產生體液免疫應答,。產生的抗體主要為IgG，此外還有少量的IgM和IgA,。對甲型流感病毒的研究發(fā)現(xiàn),，用保守核蛋白(NP)接種小鼠所產生的抗血清對病毒復制無抑制作用，而接種NP質粒的小鼠獲得的抗血清可有效地抑制病毒復制,?？梢姡蛎庖呓臃N和抗原免疫接種所獲得的體液免疫在質和量上存在一定差異,。
4DNA疫苗的優(yōu)點與安全性
DNA疫苗作為第3代疫苗，具有其自身的特點,。
4.1DNA疫苗的優(yōu)點
4.1.1易操作性和穩(wěn)定性對于質粒來說,，不管其編碼序列如何，都可用相同的方法純化和處理,，并且干燥的DNA質粒在室溫下相對穩(wěn)定,，這一點決定了DNA疫苗在熱帶地區(qū)應用的優(yōu)越性。另外,，由于其易操作性和穩(wěn)定性，也決定了DNA疫苗生產成本相對低廉,，這就為DNA疫苗在發(fā)展中國家的大規(guī)模使用鋪平了道路,。
4.1.2免疫效果好DNA疫苗在宿主細胞內表達，其加工處理過程與病毒感染的自然過程相似,，抗原遞呈過程也相同,，從而以自然的形式被加工后以天然構象遞呈給宿主的免疫識別系統(tǒng)，激發(fā)較強的免疫應答,。
4.1.3重組質粒DNA在宿主體內存在時間長持續(xù)刺激機體產生廣泛的體液免疫應答和細胞免疫應答，產生持久免疫,。選擇核心蛋白保守DNA序列制備基因疫苗,，避免免疫逃脫現(xiàn)象,。同時DNA疫苗能刺激黏膜免疫發(fā)生,，誘導免疫記憶反應[15-18]。
4.1.4DNA疫苗可用于癌癥等疑難病癥的治療研究表明,，向小鼠體內注射編碼抗體可變區(qū)基因的質?？僧a生獨特型抗體,，抗體可變區(qū)基因疫苗可用于治療B淋巴瘤,。有人把編碼人癌胚抗原(CEA)的質粒注入到小鼠舌中之后，引起了針對CEA的特異性細胞免疫和體液免疫,，這一結果為治療人類結腸癌,、乳腺癌和肺癌等疾病帶來希望。
4.1.5DNA疫苗可用于變異頻繁或血清型較多的病原免疫預防DNA疫苗在對變異頻繁或血清型較多的病原免疫預防過程中,，對于目前多價活毒疫苗防治的疾病預防和治療有重要意義,。易變異的病原如流感病毒、輪狀病毒,、藍舌病病毒、口蹄疫病毒,、雞傳染性支氣管炎病毒,。
4.1.6質粒DNA無免疫原性，可以反復使用這一特點對具有母源抗體的動物尤為重要,。
4.2DNA疫苗的安全性
DNA疫苗具有傳統(tǒng)疫苗所沒有的優(yōu)越性,，但是真正運用于人體還有許多問題有待解決。
載體DNA整合到宿主基因組內,，有導致不利轉化的可能,，如通過癌基因的插入,，導致宿主原癌基因的插入活化或抑癌基因的失活等,，如果基因疫苗散布到生殖細胞,，并發(fā)生整合,，則影響更為深遠[18-22],。
免疫效果有待提高,。實驗動物越大,，基因免疫效果越差,，在小鼠試驗中，檢測到抗體反應高,，而到其它大型的動物效果就不是很明顯。
抗DNA免疫反應,。質粒DNA會不會誘發(fā)抗雙鏈DNA的自身免疫反應,，可能引起自身免疫性疾病(系統(tǒng)性紅斑狼瘡)，正常人體中可以存在抗菌ssDNA和dsDNA抗體,，而不存在抗自身的dsDNA抗體,。利用細菌DNA免疫接種,，可以誘導產生抗哺乳動物ssDNA抗體,，但無抗哺乳動物dsDNA抗體的,。還有DNA疫苗中含原核基因組中常見的CpG基序,，易形成抗原決定簇[21],。
5結語
DNA疫苗開創(chuàng)了免疫學和疫苗學的新領域。越來越多的試驗研究發(fā)現(xiàn),，DNA疫苗在免疫防御方面有良好的效果，但DNA疫苗還面臨著許多挑戰(zhàn),，比如DNA疫苗接種的免疫學機理,，有關核酸疫苗在理論上的安全性問題等方面，還需要進一步的試驗加以闡明,。
現(xiàn)在普遍認為,，DNA疫苗應先用在傳統(tǒng)方法無法對付的病原體和疾病上。如HIV,、肺結
