中國科學(xué)院物理研究所軟物質(zhì)物理實驗室翁羽翔研究組和中科院生物物理研究所王志珍研究組合作，開展了細菌二硫鍵異構(gòu)酶（DsbC）二聚體的蛋白質(zhì)動態(tài)結(jié)構(gòu)研究,，報道了二硫鍵異構(gòu)酶的熱不穩(wěn)定性,，解釋了困惑生物學(xué)家的關(guān)于還原性二硫鍵異構(gòu)酶參與二硫鍵氧化通路這一異?，F(xiàn)象的分子機制。該工作是物理學(xué),、生物化學(xué)和分子生物學(xué)相關(guān)科研人員聯(lián)合攻關(guān),，密切合作的結(jié)果。結(jié)果刊登在2009年11月的Biophysical Journal,97,2811–2819, 2009上,。
蛋白質(zhì)的活性結(jié)構(gòu)和晶體條件下測定的“凍結(jié)”結(jié)構(gòu)并不一致,，甚至存在很大的差異，由此導(dǎo)致蛋白質(zhì)的某些生物功能完全不同于晶體結(jié)構(gòu)所對應(yīng)的情形,，出現(xiàn)預(yù)想不到的結(jié)果,。因此有必要發(fā)展生理條件下確定或部分確定蛋白質(zhì)動態(tài)結(jié)構(gòu)的物理學(xué)方法。脈沖升溫-時間分辨中紅外瞬態(tài)吸收光譜是一種具有高時間分辨率,、可以實現(xiàn)無損傷測量的蛋白質(zhì)動態(tài)結(jié)構(gòu)研究方法,。該方法通過脈沖激光熱效應(yīng)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)動態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，并由一束中紅外激光在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)指紋區(qū)探測瞬態(tài)吸收光譜,，給出蛋白質(zhì)動態(tài)結(jié)構(gòu)信息,。此前，翁羽翔研究組基于國內(nèi)技術(shù),，建立了寬譜帶測量脈沖升溫-時間分辨瞬態(tài)光譜儀,，用于蛋白質(zhì)動態(tài)結(jié)構(gòu)的研究（Biophysical Journal, 93, 2756-2766, 2007）。
二硫鍵異構(gòu)酶是由兩個單體分子通過交界面上9對氫鍵連接而成的二聚體蛋白質(zhì),，存在于細菌的周質(zhì)腔中,，和其他還原酶一道組成蛋白質(zhì)二硫鍵還原通路，負責(zé)催化蛋白質(zhì)中錯誤配對的二硫鍵的還原和異構(gòu),。 細菌周質(zhì)腔還存在由一組氧化酶蛋白質(zhì)單體（DsbA和DsbB）組成的二硫鍵氧化通路,，負責(zé)底物蛋白中自由巰基氧化形成二硫鍵。過去一直以為二硫鍵的氧化通路和還原通路各行其道,，井水不犯河水,。近年來研究發(fā)現(xiàn)，二硫鍵異構(gòu)酶對氧化通路也有貢獻,，能夠在某些條件下部分行使氧化酶的功能,。這點令生物學(xué)家困惑不解，因為之前晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)二硫鍵異構(gòu)酶是一個穩(wěn)定的二聚體,，而二聚體由于結(jié)構(gòu)位阻的原因,，不能參與氧化通路的反應(yīng)。
穩(wěn)態(tài)變溫傅立葉紅外（FTIR）光譜研究發(fā)現(xiàn),，生理條件下二硫鍵異構(gòu)酶在較低溫度下可能發(fā)生變構(gòu),。脈沖升溫-時間分辨瞬態(tài)中紅外光譜研究表明，在熱脈沖作用下,，二硫鍵異構(gòu)酶兩個單體分子結(jié)合界面間的氫鍵斷裂時間約為30納秒,，并由相應(yīng)的時間分辨瞬態(tài)紅外吸收差譜確認了單體的形成,。生物物理所進一步的生化實驗證實了二硫鍵異構(gòu)酶確實存在二聚體的熱解聚過程。最后,，王志珍研究組和美國密西根大學(xué)任國平博士從分子生物學(xué)的角度,，對比測定了一系列基因敲除菌株與野生型菌株體內(nèi)二硫鍵異構(gòu)酶的氧化酶活力，探尋該異常生物活性對溫度的依賴性,。同時也進行了體外二硫鍵異構(gòu)酶氧化氧化酶活力的測定,。體內(nèi)和體外實驗結(jié)果都證實二硫鍵異構(gòu)酶確實具有異常的氧化酶活性，并且該氧化酶活力隨溫度的升高而增加,。由此可見，二硫鍵異構(gòu)酶的熱不穩(wěn)定性使其獲得了新的氧化酶活力,，從而揭示了二硫鍵異構(gòu)酶熱解聚單體參與二硫鍵氧化通路的分子機制,。
此項工作得到了國家自然科學(xué)基金委和973項目的資助。（生物谷Bioon.com）
生物谷推薦原始出處：
Biophysical Journal, Volume 97, Issue 10, 2811-2819, 15 November 2009
Thermal-Induced Dissociation and Unfolding of Homodimeric DsbC Revealed by Temperature-Jump Time-Resolved Infrared Spectra
Heng Li, Huimin Ke, Guoping Ren, Xianggang Qiu, Yu-Xiang Weng, and Chih-Chen Wang,
Laboratory of Soft Matter Physics, Institute of Physics, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China
National Laboratory of Biomacromolecules, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China
Howard Hughes Medical Institute, Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Michigan, Ann Arbor, Michigan
The thermal stability of DsbC, a homodimeric protein disulfide isomerase in prokaryotic periplasm, has been studied by using temperature-dependent Fourier transformation infrared and time-resolved infrared spectroscopy coupled with temperature-jump initiation. The infrared absorbance thermal titration curves for thermal-induced unfolding of DsbC in D2O exhibit a three-state transition with the first transition midpoint temperature at 37.1 ± 1.1°C corresponding to dissociation, and the second at >74.5°C corresponding to global unfolding and aggregation. The dissociation midpoint temperature of DsbC in phosphate buffer shifts to 49.2 ± 0.7°C. Temperature-jump time-resolved infrared spectra in D2O shows that DsbC dissociates into the corresponding germinate monomeric encounter pair with a time constant of 40 ± 10 ns independent of the protein concentration and 77% of the newly formed monomeric encounter pair undergoes further coil to helix/loop transition with a time constant of 160 ± 10 ns. The encounter pair is expected to proceed with further dissociation into monomers. The dissociation of DsbC is confirmed by size-exclusion chromatography and subunit hybridization. The in vivo oxidase activity of DsbC attributed to the monomer has also been observed by using cadmium sensitivity and the oxidative state of β-lactamase.
