在植物、昆蟲、原生動(dòng)物體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了自然存在的RNAi現(xiàn)象,，實(shí)驗(yàn)表明通過目的基因序列的雙鏈RNA可以誘導(dǎo)產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象,。要制備較長的dsRNA，最簡單的方法就是體外轉(zhuǎn)錄合成雙向的RNA,。如果研究對(duì)象不是哺乳動(dòng)物細(xì)胞,，那要開展RNAi的實(shí)驗(yàn)就要簡單很多。因?yàn)榭梢圆捎幂^長的雙鏈RNA誘導(dǎo)RNAi現(xiàn)象,，而無需制備特定的siRNA,。在這里生物通將介紹幾個(gè)制備長鏈dsRNA的試劑盒。（值得注意的是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),，大于29nt的雙鏈RNA引發(fā)的是非特異基因沉默，21nt大小的雙鏈RNA,，也就是我們前面所說的siRNA能有效引發(fā)特異的基因沉默,。由于體外轉(zhuǎn)錄很難合成25nt以下的短鏈RNA，生物通在前面為大家介紹了一些利用試劑盒或者質(zhì)粒合成siRNA的產(chǎn)品,。參考相關(guān)文章）
MEGAscript™ RNAi Kit
合成大量純凈的雙鏈RNA是RNAi實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵,。這個(gè)基于專利的轉(zhuǎn)錄高產(chǎn)技術(shù)的產(chǎn)品正是為大量合成用于RNAi實(shí)驗(yàn)的dsRNA而優(yōu)化的。試劑盒要求用兩端帶有T7啟動(dòng)子序列的目的基因作為模板（200nt以上,，模板可以是質(zhì)粒載體上的,，也可以是用帶有T7序列的引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，另外也可以選用一個(gè)叫Lig'n Scribe Kit可以將T7 Prometor序列直接連接到DNA片斷的兩端）,，將模板和試劑盒提供的dNTP,、酶等混合，根據(jù)模板的長短進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng),。每次反應(yīng)可以合成50ug—100ug甚至更多的dsRNA(800nt以上的需要先加熱變性并褪火形成雙鏈),，產(chǎn)量是常規(guī)的10—50倍，整個(gè)試劑盒總產(chǎn)量可達(dá)2mg（20次反應(yīng),，每次100ug）,。合成的產(chǎn)物經(jīng)過DNase I消化去除DNA模板，再經(jīng)過特殊的單鏈RNase（試劑盒里提供,，后文介紹）除去單鏈的RNA,，最后經(jīng)過柱純化就得到純的雙鏈RNA，即可用于RNAi實(shí)驗(yàn),。由于這個(gè)試劑盒提供全套產(chǎn)品,，使用相當(dāng)方便。
Silencing of Drosophila hrp48 and U2AF50 Protein by dsRNA.
A. Specific Reduction of Expression Levels. 1 x 106 Schneider's Drosophila melanogaster L2 cells were grown in 6-well plates in serum-free medium and treated with 10 nM of dsRNA specific for either hrp48 or U2AF50. dsRNA were prepared with the MEGAscript RNAi Kit and post-transcriptionally labeled with Cy3 using the Silencer siRNA Labeling Kit when indicated (+). Cells were harvested 72 hours post treatment and the silencing effect was analyzed by Western blot with anti-hrp48 (48 kDa, migrates as a doublet) and anti-U2AF50 (50 kDa) antibodies. An antibody directed against Pab 1 (lower panel) was used as a second negative control. B. Dose-sensitive Reduction of Protein Expression Levels. dsRNA-triggered silencing of hrp48 was analyzed as in Figure 2a using the indicated concentrations of hrp48 dsRNA made with the MEGAscript RNAi Kit. Western analysis was also performed with the anti-U2AF50 (bottom panel) and Pab 1 (data not shown) antibodies as negative controls.
HiScribe™ RNAi Transcription Kit
RNA干涉（RNA interference)是近年產(chǎn)生的研究轉(zhuǎn)錄后剪切的一種實(shí)驗(yàn)方法,。它將目的基因所對(duì)應(yīng)的雙鏈RNA 導(dǎo)入生物體,，導(dǎo)致相應(yīng)的mRNA降解。和反義技術(shù)不同的是, 在基因表達(dá)恢復(fù)之前,，RNA干涉現(xiàn)象將持續(xù)多個(gè)細(xì)胞分裂周期,， 因而它是一種有力的研究基因功能的工具,。它不是傳統(tǒng)的在DNA水平基因敲除，而是通過RNA干涉,，在RNA水平上去除目的RNA,。這樣大量基因功能可以快速經(jīng)濟(jì)地進(jìn)行檢測。
HiScribe™ RNAi Transcription Kit也是一個(gè)體外合成雙鏈RNA進(jìn)行RNA干涉實(shí)驗(yàn)的試劑盒,。不同于前者的是,，這個(gè)試劑盒提供質(zhì)粒作為載體，方便了以后的擴(kuò)增和復(fù)制,。LITMUS™ 載體多克隆位點(diǎn)兩端帶T7啟動(dòng)子,。目的序列插入多克隆位點(diǎn)，利用T7 RNA 聚合酶同時(shí)轉(zhuǎn)錄DNA摸板的雙鏈,，合成雙鏈RNA,。載體啟動(dòng)子為T7野生型序列，是已知最強(qiáng)的啟動(dòng)子之一,，以保證轉(zhuǎn)錄產(chǎn)率的最大化,。帶有插入lacZ a片段供藍(lán)白篩選。
該試劑盒也可合成單鏈RNA,，在RNA結(jié)構(gòu)研究,，核酶化學(xué)，體外翻譯,，RNA蛋白相互作用,，反義技術(shù)等方面有廣泛應(yīng)用。該試劑盒包含 LITMUS 雙向轉(zhuǎn)錄克隆載體,，適用體外如顯微注射,、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和體內(nèi)RNA干涉在內(nèi)的所有轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。
該試劑盒包括足夠的試劑可在2ml的反應(yīng)體系中合成多至2mg的雙鏈RNA,，包括：LITMUS 28i 克隆載體,，LITMUS 38i 克隆載體（LITMUS 28i和38i二者只是多克隆位點(diǎn)有所不同），對(duì)照載體,，T7引物(19-mer), 5´-dTAATACGACTCACTATAGG-3´,，10X 含NTP的緩沖液，T7 RNA聚合酶,，上樣緩沖液和電泳Marker 2-Log DNA Ladder (100–10,000 bp)等等,。價(jià)格也相當(dāng)，3750人民幣,。但是可惜的是試劑盒沒有提供消化DNA模版和單鏈RNA的酶以及純化的工具,，需要另外購置。單獨(dú)購買的相關(guān)產(chǎn)品生物通將在后文繼續(xù)介紹。更多關(guān)于RNAi產(chǎn)品介紹請(qǐng)繼續(xù)關(guān)注生物通技術(shù)前沿專欄,。
Figure 1: 用帶插入子的 LITMUS 28i合成雙鏈RNA
Figure 2: 用HiScribe RNAi Transcription Kit體外合成單鏈和雙鏈RNA,。 LITMUS 38i 含1.3 kb熒光酶片段，分別用 PspOM I (P)和Stu I (S)剪切,。產(chǎn)生的線形摸板再分別 (P 和 S ) 或一起轉(zhuǎn)錄(P/S),，產(chǎn)生單鏈和雙鏈RNA。瓊脂糖電泳1 µl 反應(yīng)液至少含0.5 µgRNA,。
References:
Bass, B. L. (2000) Cell 101, 235–238.
Fire, A. (1999) Trends Genet. 15, 358–363.
Sharp, P. A. (2001) Genes Dev. 15, 485–490
