蘇云金芽孢桿菌ICP基因PCR鑒定的策略與進(jìn)展
林毅 黃志鵬 陳建武 黃必旺 關(guān)雄
摘 要：探討了PCR鑒定中模板來(lái)源、DNA聚合酶,、引物的選擇等三方面的策略,，并從特異復(fù)合PCR鑒定、共同復(fù)合PCR鑒定,、兩步復(fù)合PCR鑒定,、特異PCR鑒定、PCR-RFLP鑒定等五個(gè)角度對(duì)其進(jìn)展作了回顧與展望,。
關(guān)鍵詞：蘇云金芽孢桿菌; ICP基因,；PCR鑒定;策略與進(jìn)展
Strategies and Advances on PCR Identification for Insecticidal Crystal Protein Genes of Bacillus thuringiensis
Lin Yi Huang Zhipeng Chen Jianwu Huang Biwang Guan Xiong
(Biotechnology Centre of Fujian Agricultural University,Fuzhou 350002)
Abstract：In this paper，strategies on PCR identification are discussed based on DNA samples,、primers and DNA polymerases.Its advances are also reviewed in light of specific multiplex PCR,general multiplex PCR,two-step multiplex PCR,specific PCR,and PCR-RFLP.The problems and perspectives are presented as well.
Key words:Bacillus thuringiensis; ICP genes; PCR identification; strategies and advances
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,，Bt)是一種自然界中廣泛分布的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，從昆蟲(chóng),、土壤,、儲(chǔ)藏品及其塵埃、污水和植被等來(lái)源上均已分離到,，據(jù)估計(jì)全世界已分離保存的Bt菌株有60 000多個(gè),。由于它對(duì)鱗翅目、鞘翅目,、雙翅目等9個(gè)目的昆蟲(chóng)和螨類等節(jié)肢動(dòng)物,，以及動(dòng)植物寄生線蟲(chóng)、原生動(dòng)物,、扁形動(dòng)物等有特異性毒殺作用,，具有對(duì)人畜安全,、害蟲(chóng)不易產(chǎn)生抗性、易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn),，在農(nóng)業(yè),、林業(yè)和衛(wèi)生害蟲(chóng)的防治上得到了廣泛應(yīng)用。進(jìn)入90年代,，Bt產(chǎn)品占全世界生物農(nóng)藥的90 %以上[1～3]。
Bt ICP是單基因直接表達(dá)的產(chǎn)物,，不同基因型所表達(dá)的產(chǎn)物具有顯著不同的殺蟲(chóng)特異性,。自1981年Schnepf等克隆了蘇云金芽孢桿菌的第一個(gè)ICP基因,并于1985年發(fā)表了它的DNA堿基序列及其編碼蛋白的氨基酸序列起,迄今已發(fā)現(xiàn)和克隆了170多種ICP基因[4]。因此,，弄清ICP基因型,，對(duì)于菌株鑒定及篩選、殺蟲(chóng)特性的了解,、殺蟲(chóng)譜的改良等,，都具有重要意義。90年代以來(lái),，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)技術(shù)以其快速,、簡(jiǎn)便、靈敏的特點(diǎn)在Bt ICP基因的鑒定上得到了廣泛應(yīng)用,。本文就Bt ICP基因PCR鑒定的策略進(jìn)行探討,，并對(duì)其進(jìn)展作一回顧。
1 ICP基因PCR鑒定的策略
不同研究者采用的PCR鑒定策略各異,，主要表現(xiàn)在模板來(lái)源,、DNA聚合酶和引物選擇等三個(gè)方面。由于模板來(lái)源及純度的可塑性,，從相當(dāng)純的總DNA到細(xì)胞粗提物以至菌落,，只要其中的雜物不抑制DNA聚合酶的活性，所獲得的模板來(lái)源均可行,。另外,，在不同DNA聚合酶催化的條件下，并非所有模板都能以同等效率合成,，所以擴(kuò)增時(shí)應(yīng)考慮不同種類DNA聚合酶的選擇,。
引物的選擇大致可歸為以下幾類：（1）特異引物直接鑒定目的基因；（2）數(shù)對(duì)通用引物復(fù)合擴(kuò)增鑒定大類基因,，再用一系列特異引物對(duì)復(fù)合擴(kuò)增鑒定已知的基因型以及與之同源的未知基因型,；（3）共用3'端保守引物,一系列5'端特異引物附著在不同的靶位點(diǎn)上,根據(jù)產(chǎn)物分子量可判斷基因型；（4）以一對(duì)保守引物擴(kuò)增出同源基因的相應(yīng)區(qū)段(包括已知與未知基因的保守序列和非保守序列),，經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切分析,，與已知基因的限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)圖譜進(jìn)行比較,，就可以鑒定出待測(cè)菌株中所存在的已知基因，如果出現(xiàn)特異性片斷,，說(shuō)明可能存在新基因,；（5）簡(jiǎn)并引物及位于簡(jiǎn)并引物內(nèi)部的一系列特異引物混合擴(kuò)增,可很快檢測(cè)出新基因型。
2 PCR技術(shù)在Bt ICP基因鑒定中的應(yīng)用
2.1 特異復(fù)合PCR鑒定 一組特異引物復(fù)合一次擴(kuò)增鑒定多種基因型,。美國(guó)北卡羅里納CIBA-Geigy生物技術(shù)研究所Carozzi等(1991)應(yīng)用PCR技術(shù)快速預(yù)測(cè)Bt菌株的殺蟲(chóng)活性,。利用12～20個(gè)針對(duì)cryIA、cryIⅤ 和cryⅢA的特異引物,，進(jìn)行一次擴(kuò)增,，即可鑒別不同菌株對(duì)鱗翅目、雙翅目和鞘翅目的活性[5],。他們所設(shè)計(jì)的引物為同行廣泛采用[6～7],。加拿大Laval大學(xué)Bourque等(1993) 混合使用cryIA(a)、 cryIA(b)和cryIA(c)基因型特異引物,，對(duì)新分離的Bt菌株進(jìn)行鑒定[8],。哥倫比亞國(guó)立大學(xué)Ceron等(1994)用多克隆抗血清(針對(duì)cryIA(b)、cryⅢA和cryIⅤ毒性片段) ELISA分析Bt新菌株,，對(duì)確認(rèn)為含有cryI型基因的菌株,，進(jìn)一步作PCR分析。以少量的細(xì)菌裂解物為模板來(lái)源,，用反應(yīng)混合物A(含7條特異引物CJ1-7), 鑒定cryIA-ID 4個(gè)不同亞類基因,；用反應(yīng)混合物B(含6條特異引物CJ8-13), 鑒定cryIA(a)-(d) 4個(gè)不同小類基因[9]。
2.2 共同復(fù)合PCR鑒定 3'端共同引物和5' 端特異引物復(fù)合一次擴(kuò)增鑒定多種基因型,。福建農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心關(guān)雄等(1995)利用cryI基因 3'端共同引物和cryIA(a),、cryIA(b)、 cryIA(c)基因型5' 端特異性引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增,對(duì)Bt 8010 cryIA亞類基因進(jìn)行了鑒定[3],。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉子鐸等(1997)利用cryI基因 3'端共同引物和cryIA至cryIF 8種亞類5' 端特異性引物,對(duì)Bt營(yíng)養(yǎng)體直接進(jìn)行PCR分析 [10],。
2.3 兩次復(fù)合PCR鑒定 需經(jīng)兩次擴(kuò)增才實(shí)現(xiàn)基因型鑒定目的。1995年Ceron等運(yùn)用一種新的PCR技術(shù),，快速鑒定已知的cryI及cryⅢ基因型,。以2對(duì)通用引物進(jìn)行一次擴(kuò)增分析，對(duì)含有此類基因型的菌株,，用各種特異引物進(jìn)行二次擴(kuò)增分析,，可鑒定出10種cryI基因型及5種cryⅢ基因型[11]。法國(guó)CIRAD的Juarez-Perez等(1997)為鑒定ICP新基因,，創(chuàng)立了E-PCR （exclusive PCR）技術(shù),。以片段，并從該片段內(nèi)部選擇設(shè)計(jì)了一系列特異引物擴(kuò)增特定的cryI基因型,，待測(cè)菌株中不存在未知的cryI基因型時(shí),，特異引物的競(jìng)爭(zhēng)力勝過(guò)簡(jiǎn)并引物,，家族片段將無(wú)法產(chǎn)生；如果至少存在一種新的cryI基因型,，產(chǎn)物中將出現(xiàn)家族片段,。混合應(yīng)用簡(jiǎn)并引物和特異引物進(jìn)行一次擴(kuò)增分析,鑒定出已知的cryI基因型,然后經(jīng)二次擴(kuò)增分析, 排除已知基因,檢測(cè)出未被識(shí)別的未知基因型 [12],。以色列Ben-Gurion大學(xué)生命科學(xué)系Ben-Dov等(1997)運(yùn)用兩次復(fù)合PCR,，快速鑒定對(duì)鱗翅目、鞘翅目,、雙翅目害蟲(chóng)有效的ICP基因,。設(shè)計(jì)的5對(duì)通用引物，可擴(kuò)增出20種cry1,、3種cry2,、4種cry3,、2種cry4,、2種cry7和以及3種cry8基因型的相應(yīng)區(qū)段。之后,，以一套特異引物進(jìn)行二次擴(kuò)增分析,，鑒定出具體的基因型。對(duì)126個(gè)新菌株的鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn),，存在22種不同的cry基因組合,，其中38個(gè)菌株可能含有與cry7、cry8同源的未知基因[13],。
2.4 特異PCR鑒定 一次擴(kuò)增反應(yīng)只鑒定單個(gè)基因型,。美國(guó)Sandoz公司Kalman等(1993)首創(chuàng)了PCR footprinting鑒定技術(shù)。從cryIC型基因序列高變異區(qū)選擇設(shè)計(jì)了6對(duì)特異引物,，經(jīng)PCR擴(kuò)增,，比較不同菌株擴(kuò)增的指紋圖譜，即可鑒定出已知的和新的cryIC型基因,。運(yùn)用該方法在蠟螟變種DH29菌株中發(fā)現(xiàn)了cryIC(b)新基因[14],。該技術(shù)已引起人們廣泛興趣，1994年臺(tái)灣Chak等和1998年我國(guó)高梅影等也分別開(kāi)展了此項(xiàng)工作[7,15],。
2.5 PCR-RFLP鑒定 基因型的鑒定有賴于擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶切分析,。日本北海道大學(xué)農(nóng)學(xué)部淺野真一郎等(1993)根據(jù)cryⅡ擴(kuò)增產(chǎn)物的HincⅡ酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性區(qū)分cryⅡA與 cryⅡB。該方法能有效地鑒定出對(duì)鱗翅目和雙翅目害蟲(chóng)均有效的Bt菌株[16],。新西蘭奧克蘭園藝及食品研究院Gleave等(1993)從21個(gè)Bt血清型中擴(kuò)增出的7個(gè)cryⅤ類基因擴(kuò)增產(chǎn)物,經(jīng)KpnI酶切分析,至少可將它們分為三個(gè)亞類[17],。臺(tái)灣國(guó)立揚(yáng)名大學(xué)生命科學(xué)院Kuo和Chak(1996)明確提出了PCR-RFLP鑒定體系，并首先對(duì)成員眾多的cryI 類基因進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定[18],。國(guó)內(nèi)對(duì)PCR-RFLP鑒定體系也顯示出極大熱情,。1998年,，中國(guó)農(nóng)科院植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室率先開(kāi)展了這方面的工作，建立了cry2,、cry3,、cry4/10和cry5基因的鑒定體系，并進(jìn)一步將Kuo和Chak所能鑒定的11種cry1/7/9基因家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建立了cry 1,、cry2,、cry3、cry4,、cry5,、cry7、cry8,、cry9,、cry19、cyt1和cyt2等類型基因的鑒定體系[20],。
3 問(wèn)題與展望
分子生物學(xué)飛速發(fā)展的一個(gè)重要因素是其把新技術(shù)和利用新技術(shù)積極解決新問(wèn)題有效地結(jié)合起來(lái),。PCR使Bt ICP基因鑒定變得簡(jiǎn)單易行，就代表了這樣一種變化,。以往,，對(duì)Bt ICP基因的鑒定，人們?cè)O(shè)想用基因組DNA指紋圖譜及生化測(cè)定,，但該法不適于大量鑒定,；而Southern雜交與單克隆抗體因昂貴費(fèi)時(shí)等原因也受到限制。Bt新菌株ICP基因內(nèi)容的系統(tǒng)鑒定有兩條途徑,。一是兩步復(fù)合PCR或共同復(fù)合PCR,，主要用于已知基因的鑒定，需要合成多條引物,，而且基因型的復(fù)合鑒定不及分開(kāi)鑒定可靠,。二是PCR-RFLP，該方法無(wú)疑較為理想,，僅需數(shù)對(duì)引物,，即可鑒定出已知的基因，并檢測(cè)出未知的基因,。但PCR-RFLP也存在一些問(wèn)題,，如兩保守區(qū)間非酶切位點(diǎn)部位的一些重要變異可能被忽略等。此外,，PCR-RFLP還可以測(cè)定基因拷貝數(shù)及定量測(cè)定轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量差異[20],。
特異PCR 鑒定中，PCR footprinting技術(shù)作為檢測(cè)新型目的基因的“法寶”將倍受青睞。它可以檢測(cè)出基因內(nèi)部的細(xì)微差異,，但需要合成較多引物,，成本較高。不可否認(rèn),，PCR鑒定本身也存在諸如低拷貝殺蟲(chóng)基因可能被忽略,、沉默的殺蟲(chóng)基因干擾殺蟲(chóng)活性的預(yù)測(cè)等缺陷,特別是為尋找對(duì)靶蟲(chóng)更有效或結(jié)合靶蟲(chóng)不同受體的毒蛋白時(shí),無(wú)法提供直接信息。PCR鑒定發(fā)現(xiàn),，Bt野生菌株中存在“雜合基因”,是研究ICP基因進(jìn)化的極好材料,。經(jīng)鑒定含有單基因類型的菌株,為研究單基因的結(jié)構(gòu)與功能及進(jìn)行基因間組合,為研究基因間的相互作用提供了很好的材料。
科技部"九五"攻關(guān)課題96-C01-02-01及國(guó)家計(jì)委85-504-21-01攻關(guān)課題
林毅(福建農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心,，福州 350002)
黃志鵬(福建農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心,，福州 350002)
陳建武(福建農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心，福州 350002)
黃必旺(福建農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心,，福州 350002)
關(guān)雄(福建農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心,，福州 350002)
參 考 文 獻(xiàn)
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