艾滋病是嚴重威脅我國人民健康的疾病之一，目前在我國流行趨勢依然嚴峻,。衛(wèi)生部,、聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署和世界衛(wèi)生組織聯(lián)合評估顯示，截至2009年底,，累計報告艾滋病病毒感染者和艾滋病病人32.6萬例,，其中艾滋病病人10.7萬例，死亡報告5.4萬例，估計中國存活艾滋病病毒感染者和病人約74萬人,，其中艾滋病病人為10.5萬人,。HIV感染的實驗室檢測在HIV感染的診斷、疾病進展的監(jiān)測,、抗病毒療效觀察和耐藥監(jiān)測中至關(guān)重要,，是艾滋病防治工作的重要基礎(chǔ)。目前臨床檢測內(nèi)容包括HIV抗體,、P24抗原,、HIV病毒載量、HIV耐藥檢測,、CD4+T淋巴細胞計數(shù)等,。為滿足目前艾滋病檢測工作的實際需要，2009年9月中國疾病預防控制中心頒布了《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范（2009年版）》,，對2004年版的內(nèi)容進行了修改、增補和完善,。HIV的檢測必須遵守國家制定的《艾滋病檢測工作管理辦法》和《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范（2009年版）》（以下簡稱《規(guī)范》）,，嚴格進行。
一,、HIV抗體檢測
HIV抗體檢測不同于其他病原微生物的檢測,，任何錯誤的診斷，包括假陽性或假陰性,，都會對被檢者甚至他人造成重要的影響,。因此，HIV抗體檢測必須嚴格按照《規(guī)范》要求,，由接受過專門技術(shù)培訓并獲合格證書的技術(shù)人員在當?shù)匦l(wèi)生行政部門審批合格的實驗室中進行,，整個實驗過程應(yīng)有嚴格的質(zhì)量保證體系。
HIV抗體檢測分為篩查試驗和確證試驗,，可用于診斷（確定個體HIV感染狀況）,、監(jiān)測（了解不同人群HIV感染率及其變化趨勢）及血液篩查（防止輸血傳播HIV）。篩查試驗根據(jù)檢測原理不同分為酶聯(lián)免疫吸附法,、凝集法和層析法,，可對血液、唾液和尿液標本進行常規(guī)或快速檢測,。臨床用于血液篩查的方法包括酶聯(lián)免疫試驗（ELISA）,、免疫熒光法、化學發(fā)光法等,，常用的為酶聯(lián)免疫法（ELISA）,。自1985年第一代ELISA試劑問世以來，隨著醫(yī)學技術(shù)的發(fā)展，包被抗原已從一代的全病毒裂解物發(fā)展為目前以基因重組和多肽抗原包被和標記,、有著良好敏感性和特異性的三代雙抗原夾心試劑,，檢測亞型包括HIV-1、 HIV-2和HIV-1型的O亞型,。第四代ELISA可同時檢測P24抗原和HIV-1/2抗體,，進一步縮短了窗口期。此外,，按《規(guī)范》要求,，快速檢測由于簡便快速，適用于應(yīng)急檢測,、門診急診檢測,，包括明膠顆粒凝集試驗、斑點ELISA,、斑點免疫膠體金快速試驗,、艾滋病唾液檢測卡等。對用ELISA試劑或快速診斷試劑進行的篩查實驗如呈陰性反應(yīng),，即報告HIV抗體陰性,；對呈陽性反應(yīng)的標本，篩查實驗室應(yīng)用原有試劑和另外一種不同原理或不同廠家的試劑,，或另外兩種不同原理或不同廠家的試劑進行復檢試驗,。如兩種試劑復測均呈陰性反應(yīng)，則報告HIV抗體陰性,；如均呈陽性反應(yīng),，或一陰一陽，需送艾滋病確認實驗室進行確認,。篩查試劑必須是HIV-1/2混合型,、經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局（SDA）注冊批準、批檢合格,、在有效期內(nèi),、推薦使用經(jīng)臨床質(zhì)量評估敏感性和特異性均高的試劑。
HIV抗體篩查呈陽性反應(yīng)的標本由于存在假陽性的可能,，必須進行確證試驗,。其方法包括免疫印跡試驗、條帶免疫試驗,、放射免疫沉淀試驗及免疫熒光試驗,，目前以免疫印跡試驗最為常用。確認試劑必須是經(jīng)SDA注冊批準,、在有效期內(nèi)的試劑,。免疫印跡試劑有HIV-1/2混合型和單一型,，按《規(guī)范》要求，先用HIV-1/2混合型試劑進行檢測,，根據(jù)《規(guī)范》中判定免疫印跡試驗結(jié)果的基本原則并參照所用試劑說明書綜合判定,，無HIV抗體特異帶出現(xiàn)的報告HIV抗體陰性；出現(xiàn)HIV抗體特異帶,，符合HIV-1抗體陽性判定標準,，則報告HIV-1抗體陽性。如出現(xiàn)HIV-2型的特異性條帶,，需用HIV-2型免疫印跡試劑再做HIV-2型抗體確證試驗,，呈陰性反應(yīng)，報告HIV-2抗體陰性,；呈陽性反應(yīng)的則報告HIV-2抗體血清學陽性,，如需鑒別應(yīng)進行核酸序列分析。如果出現(xiàn)HIV抗體特異帶,，但不足以判定為陽性,，則判為HIV抗體不確定。對HIV抗體不確定者,，新版《規(guī)范》修改了隨訪的時間,，將3個月的隨訪周期縮短為4周，要求在4周后隨訪檢測,，如帶型沒有進展或呈陰性反應(yīng)，則報告陰性,；如隨訪期間出現(xiàn)符合判定標準的HIV-1抗體陽性反應(yīng),，則報告陽性；如隨訪期間帶型有進展,，但不滿足陽性標準,，應(yīng)繼續(xù)隨訪到8周。第8周時如帶型沒有進展或呈陰性反應(yīng)則報告陰性,；滿足HIV抗體陽性診斷標準則報告陽性,，不滿足陽性判斷標準可視情況決定是否繼續(xù)隨訪。
為確保HIV抗體篩查的準確性,，在所有實驗中必須包含有內(nèi)部對照質(zhì)控血清和外部對照質(zhì)控血清,。內(nèi)部對照質(zhì)控血清指試劑盒內(nèi)提供的陽性和陰性對照血清，是質(zhì)量控制的基礎(chǔ),，每次檢測必須使用內(nèi)部對照,，而且只能在同批號的試劑盒中使用。外部對照質(zhì)控血清是由實驗室設(shè)置的弱陽性對照,，一般以該試劑盒臨界值（Cut off）的2-3倍為宜,，可購買或由實驗室自己制備,。此外，全國各艾滋病篩查實驗室需參加本省艾滋病確認中心實驗室組織的室間質(zhì)量評價,，各艾滋病確認中心實驗室和艾滋病確證實驗室需參加國家艾滋病參比實驗室組織的室間評價,，以確保HIV抗體檢測質(zhì)量。
二,、HIV-1 P24抗原檢測
HIV-1 P24抗原檢測可用于HIV-1抗體不確定或窗口期的輔助診斷,；HIV-1抗體陽性母親所生嬰兒早期的輔助鑒別診斷；第四代HIV-1抗原/抗體ELISA試劑檢測呈陽性,，但HIV-1抗體確認陰性者的輔助診斷,。P24抗原檢測一般用ELISA雙抗體夾心法試劑，試劑必須經(jīng)過SDA批準注冊,、在有效期內(nèi),，其陽性結(jié)果必須依據(jù)試劑說明書經(jīng)中和試驗確認。HIV-1P24抗原檢測的敏感性為30-90%,，該結(jié)果僅作為HIV感染的輔助診斷依據(jù),，不能據(jù)此確診；HIV-1 P24抗原檢測陰性只表示在本試驗中無反應(yīng),，不能排除HIV感染,，臨床中一般不作為常規(guī)診斷項目。
三,、HIV RNA定量測定（病毒載量檢測）及HIV核酸定性檢測
HIV核酸檢測可用于HIV感染的輔助診斷,、病程監(jiān)控、指導治療方案及療效判定,、預測疾病進展等,。常用的HIV病毒載量檢測方法包括逆轉(zhuǎn)錄PCR實驗（RT-PCR）、核酸序列擴增實驗（NASBA）,、分支DNA雜交實驗（bDNA）以及實時熒光定量PCR技術(shù),。值得注意的是，每一種HIV
RNA定量系統(tǒng)都有其最低檢測限,，即可以測出的最低拷貝數(shù)或國際單位,，RNA定量檢測時未測出不等于樣品中不含有病毒RNA，因此HIV核酸定性檢測陰性,，只可報告本次實驗結(jié)果陰性,，但不能排除HIV感染；HIV核酸檢測陽性,，可作為診斷HIV感染的輔助指標,，不能單獨用于HIV感染的診斷。報告HIV核酸定量檢測結(jié)果時應(yīng)按照儀器讀數(shù)報告結(jié)果,，注明使用的實驗方法,、樣品種類和樣品量,，當測定結(jié)果小于最低檢測限時，應(yīng)注明最低檢測限水平,。
HIV核酸定性檢測也可用于HIV感染的輔助診斷,，目前在分析HIV基因亞型和變異等基礎(chǔ)研究中應(yīng)用。通常使用PCR或RT-PCR技術(shù),，使用分子生物學實驗室通用的擴增試劑,，引物可來自文獻或自行設(shè)計，應(yīng)盡量覆蓋所有或常見的毒株,，也可使用復合引物,。報告定性檢測結(jié)果時應(yīng)注明反應(yīng)條件和所使用的引物序列。此外,，利用核酸檢測方法的高度敏感性,，使用集合核酸擴增檢測技術(shù)和方法，對高度懷疑感染人群且抗體陰性的樣品進行集合核酸檢測,，可及時發(fā)現(xiàn)窗口期感染者,。該方法較單份樣品的核酸檢測具有更高的成本效益。
四,、CD4+ T淋巴細胞計數(shù)
CD4+T淋巴細胞是人體免疫系統(tǒng)最重要的細胞之一,。HIV以CD4+T淋巴細胞為靶細胞，感染后可導致CD4+T淋巴細胞進行性下降,，使機體免疫功能受損,，最終因機會性感染及腫瘤而死亡。CD4+T淋巴細胞絕對值的檢測在HIV感染的以下方面發(fā)揮了重要作用：了解機體的免疫狀態(tài)以確定疾病分期,、監(jiān)測疾病進程,、評估疾病預后、制定抗病毒治療及機會性感染預防性治療方案及評估抗病毒治療療效等,。目前用于CD4+T淋巴細胞檢測的方法分為自動檢測方法和手工操作法。自動檢測方法包括流式細胞儀（單平臺一步法,、多平臺三級程序法）和專門的細胞計數(shù)儀,，手工操作方法則需要顯微鏡或酶聯(lián)免疫試驗設(shè)備。目前檢測CD4+T淋巴細胞數(shù)的標準方法為流式細胞儀,，可得出CD4+T淋巴細胞,、CD8+T淋巴細胞的絕對值及占淋巴細胞的百分率。為確保檢測的準確性,，應(yīng)制定質(zhì)量保證計劃,，建立內(nèi)部質(zhì)量控制制度，并參加室間質(zhì)量評價,。
五,、抗病毒治療的耐藥監(jiān)測
高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療為目前針對HIV最有效的治療,，但由于HIV可產(chǎn)生自發(fā)性高頻率的基因突變，在抗病毒藥物選擇性壓力下,，HIV的突變可促使HIV耐藥株的產(chǎn)生,，并進一步引起多種藥物交叉耐藥，成為遏制AIDS流行的主要障礙之一,。目前常用的耐藥檢測方法包括基因型和表型HIV耐藥檢測,。當病毒對某些藥物產(chǎn)生耐藥時，病毒基因會發(fā)生一些明確的突變,，因此,，可應(yīng)用病毒耐藥基因型的檢測預測某些藥物的治療效果。其方法為從患者血液標本中分離HIV核酸物質(zhì),，進行核酸序列分析,，確定與耐藥性相關(guān)的病毒變異位點。在確認變異后,，與既往耐藥或交叉耐藥研究比較,，間接地估計藥物耐藥情況，簡單快速,，費用低,，結(jié)果分析較復雜，需由專業(yè)人員進行,?；蛐湍退帣z測方法有時并不能解釋某些耐藥突變之間的相關(guān)性，如各突變之間是否有協(xié)同或者抵抗作用,。目前我國進行的耐藥性檢測主要為基因型耐藥檢測,。衛(wèi)生部指導建立的全國HIV耐藥性監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)可及時掌握耐藥毒株出現(xiàn)的情況以及影響因素，為國家HIV抗病毒治療提供了技術(shù)保障,。表型HIV耐藥性檢測包括傳統(tǒng)的共培養(yǎng)方法和重組病毒表型檢測方法,，能直接測出感染毒株對藥物的敏感度，并能揭示事先存在或交叉的耐藥情況,，有利于指導HIV-1 感染者有效地用藥,。不足之處為試驗慢且費用昂貴，技術(shù)要求高,，多種影響因素導致重復性差,，多需在P3級生物安全實驗室中進行，因此,，其在臨床上的應(yīng)用受到限制,。
六、HIV病毒分離
HIV病毒培養(yǎng)及分離可用于HIV-1感染的輔助診斷,。HIV病毒分離需要在P3級生物安全實驗室進行,，實驗條件及技術(shù)要求較高,，目前多用于HIV相關(guān)的科學研究。
綜上,，隨著我國艾滋病防控力度的不斷加大,，對于監(jiān)測和檢測技術(shù)的要求也不斷提高，艾滋病檢測工作量日趨增加,。在現(xiàn)有基礎(chǔ)上進一步完善實驗室檢測的技術(shù)及質(zhì)量控制,，滿足國家艾滋病防治對于監(jiān)測檢測工作的要求，是從事艾滋病檢測工作人員義不容辭的責任,。(生物谷Bioon.com)
第四屆中英癌癥生物學前沿研討會暨CDDIS-中國上海研討會 2013年5月8-9日 中國上海
