日前,，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍骨科研究所以及該院整形外科、腫瘤科專家,，在國家自然科學(xué)基金資助下,，成功地應(yīng)用人工TATA盒(基本轉(zhuǎn)錄因子TFIID結(jié)合位點(diǎn)，位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-25~-30bp,，控制轉(zhuǎn)錄起始的準(zhǔn)確性及頻率)對人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶亞基(hTERT)核心啟動子進(jìn)行了修飾,，并利用其構(gòu)建了小發(fā)卡狀RNA(sh  RNA)表達(dá)載體，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了腫瘤特異性RNA干擾(RNAi),。該研究為進(jìn)一步提高基于RNAi技術(shù)的基因治療方法的安全性奠定了基礎(chǔ),。  

　　已有研究表明，在85%以上的人類腫瘤細(xì)胞中,，存在端粒酶的再激活,。而作為腫瘤特異性啟動子--hTER  T，目前已被廣泛用于靶向轉(zhuǎn)錄基因治療研究中,。RNA干擾是指雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的同源mRNA高效降解現(xiàn)象,。該現(xiàn)象普遍存在于植物,、真菌、線蟲,、果蠅和哺乳動物中,，并在其進(jìn)化中高度保守。目前,，RNAi已經(jīng)成為篩選新基因,、探索基因功能和尋找有效藥物靶點(diǎn)的重要工具。

　　為修飾hTERT核心啟動子,，構(gòu)建shRNA表達(dá)載體,，實(shí)現(xiàn)腫瘤特異性RNA干擾，西京醫(yī)院的研究人員使用人工TATA盒修飾hTERT核心啟動子,，重建轉(zhuǎn)錄起點(diǎn),；將含有修飾后hTERT啟動子的MluI/XhoI片斷克隆至pGL3-OCP-shLuc的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，以獲得pGL3-mhTERT-shLuc,；設(shè)計(jì)了針對p53的s  hRNA編碼序列,，并通過將XhoI/XbaI克隆至pGL3-mhTERT-shLuc的相應(yīng)酶切位點(diǎn)之間，來獲得  pGL3-mhTERT-shp53,；利用pGL3-mhTERT-shLuc與pGL3-control共轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞U20S,、MG-63和H0S，并以共轉(zhuǎn)染lμgpGL3-control和lμgpGL3-mhTERT作為對照組,，48小時(shí)后測定熒光素酶活性,，并計(jì)算相對活性；利用WesternBlot法分析轉(zhuǎn)染前后p53的表達(dá)水平,。

　　該研究獲得三項(xiàng)重要成果：經(jīng)雙酶切鑒定和DNA測序證實(shí),，pGL3-mhTERT-shLuc和pGL3  -mhTERT-shp53的序列與研究設(shè)計(jì)完全一致；pGL3-mhTERT-shLuc與pGL3-contro  l共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),，hTERT-U20S細(xì)胞熒光素酶的相對活性與對照組相比沒有明顯差異,，而hTERT+的MG-6  3和H0S細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后，其熒光素酶相對活性顯著降低,，與對照組相比其抑制效率可分別達(dá)到69.7%和71.0%,；W  esternBlot分析表明,，與轉(zhuǎn)染pGL3-mhTERT相比,，使用pGL3-mhTERT-shp53轉(zhuǎn)染MG  -63和H0S后，可顯著抑制p53表達(dá),，而U20S的p53的表達(dá)水平,，與對照組沒有明顯改變。

　　據(jù)研究人員介紹,，由于hTERT啟動子是公認(rèn)的腫瘤特異性啟動子,，而且hTERT高表達(dá)于多種類型腫瘤細(xì)胞和瘢痕組織中的成纖維細(xì)胞中,，所以該啟動子經(jīng)修飾后不僅可用于乳腺癌、黑色素瘤,、骨肉瘤等多種類型腫瘤的靶向基因治療,，而且可用于靶向殺傷瘢痕組織中的成纖維細(xì)胞，從而達(dá)到安全,、有效治療腫瘤和瘢痕的目的,。上述研究通過對hTERT  核心啟動子進(jìn)行修飾并構(gòu)建shRNA表達(dá)載體，成功實(shí)現(xiàn)了腫瘤特異性RNAi干擾,，大大提高了基于RNAi的基因治療策略的安全性,。