暨南大學(xué) 移植與免疫中心
基因組測序以及隨后的DNA陣列試驗的興起已經(jīng)獲得大量有關(guān)基因序列，組裝和表達(dá)的信息,。因而人們期望能對基因組編碼的所有蛋白進(jìn)行類似的系統(tǒng)研究,。特異抗體庫或其他配基庫將是必備的工具。由于傳統(tǒng)免疫方法不可能產(chǎn)生足夠數(shù)量抗體,，所需純度以及重復(fù)性也不能滿足要求,，因而人們將需要應(yīng)用體外抗體選擇方法。
完整基因組測序或者草圖已經(jīng)在越來越多的生物中完成，這包括人,，酵母和其他一些種類（微生物基因組列表見www.tigr.org/tigr-scripts/CMR2/CMRHomePage.spl）,。基因組測序完成使科研人員可以進(jìn)行基因組水平研究,，對酵母的研究最深入透徹,。之所以對酵母研究這么深入，主要是因為在酵母中容易通過同源重組把內(nèi)源性基因替換成修飾過的基因,。然而,，在多數(shù)生物中很難利用這一強(qiáng)大技術(shù)，將表達(dá)標(biāo)簽連到每個基因產(chǎn)物上,。唯一的方法就是篩選所有基因產(chǎn)物的特異結(jié)合配基,。在傳統(tǒng)方法中應(yīng)用的結(jié)合配基是抗體，如蛋白質(zhì)印跡,，流式細(xì)胞術(shù)，免疫沉淀反應(yīng),，免疫熒光,，免疫組織化學(xué)和純化，只不過過去是分析單個基因,，而現(xiàn)在則是分析蛋白質(zhì)組,。除了這些用途以外，結(jié)合配基還可用于新的蛋白質(zhì)組技術(shù),，如抗體芯片和生物傳感器,。
傳統(tǒng)方法使用的抗體，有多克隆抗體和單克隆抗體,。多克隆抗體通常使用蛋白,，結(jié)合肽或DNA表達(dá)載體免疫動物獲得。多克隆血清中的不同抗體可以識別單一抗原,，實用性很強(qiáng)（多克隆抗體能在許多實驗中應(yīng)用）,，但重復(fù)性差（每個多克隆血清即使來自同一動物，也是特異的,，不可重復(fù)的）,。引進(jìn)雜交瘤技術(shù)可以消除多克隆抗體交叉反應(yīng)和背景的問題，并且產(chǎn)生大量確定特異性的單克隆抗體,。然而,，盡管非常有用，但單克隆技術(shù)很難在高通量技術(shù)中應(yīng)用,，也存在毒性和免疫原性差的問題,。所以采用一套新的技術(shù)，通常稱為生物分子多樣性（biomolecular diversity）或生物分子展示技術(shù)是很必要的。
概括起來講,，這種技術(shù)就是從大型配基庫中篩選特異配基,，主要包括幾個步驟，每步都有一些共同的特征（見表一）,。通常需要進(jìn)行2-3次重復(fù)才能直接掃描到合適的結(jié)合配基,。如果這個配基庫的質(zhì)量很好，通常所有的靶都能找到合適的配基,。生物分子多樣性技術(shù)的第一個例子是肽,，使用的技術(shù)是噬菌體展示技術(shù)，肽被連接到絲狀噬菌體一種衣殼蛋白上,。這個平臺技術(shù)用來鑒定單克隆抗體結(jié)合抗原決定簇,。除了噬菌體展示之外，細(xì)菌和酵母也被用作微生物展示技術(shù),，而核糖體展示和嘌呤霉素展示（mRNA或cDNA直接與它們編碼的多肽相連）在體外也被應(yīng)用,。
所有這些都是物理選擇方法，需要大量選擇因子（selector,？,？？）完成掃描和篩選,。一些遺傳學(xué)方法也被用于篩選特異性結(jié)合配基,。這些方法不需要選擇因子，而是依賴原位合成以及配基與靶分子之間的相互作用,。酵母雙雜交系統(tǒng)和蛋白互補(bǔ)實驗已經(jīng)用于模式系統(tǒng)篩選scFv,，不需要抗原合成和純化就能進(jìn)行選擇。
不同基因組計劃處于不同研究階段,，因而沒有一個方法適合所有基因組,。如果有純化的蛋白質(zhì)，物理篩選方法將非常有效,。如果僅有基因組序列是可用的,，依賴配基與靶之間相互作用的遺傳篩選方法可能更有效，它不需要純化蛋白質(zhì),。然而無論使用那種方法,，鑒定所選抗體特異性總是一個重點和難點。
--------------------------------------------------------------------------------
物理篩選方法
運(yùn)用物理方法選擇靶蛋白相應(yīng)結(jié)合配基,，所用的選擇因子需要經(jīng)過純化,。有兩種常用物理選擇方法：第一種，抗原固定到固體支持物上,，與抗體庫一起溫育,，待抗體與抗原識別并結(jié)合之后,，將非結(jié)合抗體沖洗掉，再將特異抗體洗脫收集,；第二種方法就是,，標(biāo)記抗原（常用生物素或熒光標(biāo)記），然后篩選與之特異結(jié)合的抗體,。在噬菌體,，細(xì)菌和酵母展示技術(shù)中，活的生物體用于擴(kuò)增和展示并將表現(xiàn)型,，基因型結(jié)合起來,；而核糖體和嘌呤霉素mRNA展示技術(shù)依賴PCR擴(kuò)增，RNA體外翻譯獲得配基,，接著分別以非共價鍵和共價鍵結(jié)合到相應(yīng)cDNA,。這些方法通常需要幾輪篩選。最近已經(jīng)建立了大型天然酵母展示庫,，根據(jù)親和力篩選某靶的特異抗體效果與噬菌體庫一樣好,。
應(yīng)用物理篩選方法的主要瓶頸是要得到足夠數(shù)量的抗原來進(jìn)行篩選和掃描。有兩個基本篩選和掃描方法：基于基因和基于蛋白質(zhì)組,?；蚝Y選方法中，選擇因子特性是預(yù)先知道的,，獲得的抗體特異性是明確的。合成肽,，多肽片段或重組全長蛋白是適宜的選擇因子,。蛋白質(zhì)組篩選方法使用的是天然成分（如組織或細(xì)胞抽提物）。獲得的抗體所識別抗原的特性需要鑒定,。在2D凝膠電泳分離之后,，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用噬菌體抗體進(jìn)行篩選,。盡管可以使用天然蛋白進(jìn)行篩選,，高通量掃描和鑒定適宜的結(jié)合配基仍是個關(guān)鍵問題，還是需要得到足夠數(shù)量的選擇因子,。舉個例子,，一些蛋白在血清中濃度是1 pg /ml,至少需要純化1000升才能得到1ug?；蚝Y選方法最大優(yōu)點就是抗原特性預(yù)先知道,，因而可以得到足夠數(shù)量的抗原；而蛋白質(zhì)組最大的優(yōu)點就是抗原是處于天然狀態(tài),，保留翻譯后修飾的特征,。
噬菌體和酵母展示
噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于選擇抗體,。克隆大量不同抗體基因于衣殼蛋白3基因的上游,，噬菌體或噬菌粒作為展示載體,，建立了噬菌體抗體庫。大多數(shù)噬菌體抗體庫是使用scFvs作為抗體形式,，有報道一個大型Fab 庫也已經(jīng)建立了,。抗體基因克隆于基因3的上游區(qū),，抗體與基因3衣殼蛋白組成融合蛋白,。噬菌體抗體庫理論上含有1011種（這是通過計算獨立克隆數(shù)得到的）?？贵w庫多樣性是受到細(xì)菌轉(zhuǎn)染效率限制的,。VH和VL基因克隆之后用cre重組酶進(jìn)行基因重組，通過這種方法可以建立一個大得多的抗體庫,。
從天然噬菌體抗體庫篩選的抗體表達(dá)水平有很大差異（從10ug/L到20mg/L）,，能夠被誘發(fā)高水平表達(dá)。現(xiàn)在已經(jīng)知道（至少在酵母中是這樣）,，scFv穩(wěn)定性,，表達(dá)和展示是相關(guān)的，改進(jìn)任何一個參數(shù)很可能同時提高其它參數(shù),，這意味著增加scFvs細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性的一些方法可以增強(qiáng)表達(dá),。
體外展示系統(tǒng)
這種方法是在翻譯之后，將基因與它們所編碼的蛋白相連,。在RNA展示中,，嘌呤霉素將RNA與它們所編碼蛋白共價相連，在核糖體展示中核糖體自身就是基因和蛋白的連接體,。初步篩選得到的scFvs與從噬菌體抗體庫篩選的scFvs親合力相似,。噬菌體展示技術(shù)經(jīng)過2-3輪篩選可以得到陽性克隆，而體外展示技術(shù)則需要更多輪篩選,。盡管需要更多輪篩選,，然而體外展示技術(shù)可以得到pM親和力的抗體，也能進(jìn)行高通量篩選,。選定之后,，抗體或其它結(jié)合配基通常克隆到細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中,，體外翻譯系統(tǒng)目前還沒有使用過,。并不是所有體外展示篩選的抗體都能很好的在細(xì)菌中表達(dá)，這是一個很大的瓶頸,。
遺傳篩選方法
如果有物理篩選因子,，物理方法是篩選結(jié)合配基一個很好的辦法,。這個領(lǐng)域發(fā)展很快，一些研究小組已經(jīng)在基因組水平得到少量蛋白質(zhì),，然而在大多數(shù)蛋白質(zhì)組計劃中都缺乏足夠數(shù)量的選擇因子,。一個途徑是避免全部使用物理篩選因子，建立遺傳篩選方法,，使用編碼全部或部分目的基因DNA序列,。從庫中篩選結(jié)合配基的本質(zhì)是蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，酵母雙雜交系統(tǒng)是使用最廣泛的遺傳篩選手段鑒定這種相互作用,。在理想條件下,，克隆目的基因作為"誘餌"，轉(zhuǎn)染抗體庫進(jìn)行篩選,。然而目前大多數(shù)抗體庫包含50億多個克隆,，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過酵母轉(zhuǎn)染能力。所以需要進(jìn)行一輪初篩選,，將目的蛋白克隆到酵母雙雜交載體中,。這可以降低文庫多樣性至105-106，允許篩選不同scFvs,但它在進(jìn)行遺傳選擇之前還是需要物理選擇因子,。而且,，在遺傳篩選方法中，大多數(shù)scFvs在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中是沒有功能的,，因為它們需要二硫鍵保持穩(wěn)定,，這在還原性的細(xì)胞質(zhì)環(huán)境中是不能形成的。
遺傳篩選之前可以通過細(xì)菌遺傳系統(tǒng)或蛋白互補(bǔ)實驗進(jìn)行物理篩選,。細(xì)菌遺傳系統(tǒng)依賴轉(zhuǎn)錄活化作用而蛋白互補(bǔ)實驗中細(xì)胞存活所必須的酶（如二氫葉酸還原酶或b-內(nèi)酰胺酶)分成兩部分,，只有當(dāng)兩部分組合在一起才有活性。當(dāng)存在兩種相互作用的因子如抗原與抗體,，這兩個部分可以組合起來酶就具有活性。用模式抗體和DHFR進(jìn)行的預(yù)實驗表明特異抗原抗體相互作用使細(xì)胞更容易存活,，比非特異作用效率高107倍,。這種方法與Escherichia coli高水平轉(zhuǎn)染效率方法結(jié)合起來在蛋白質(zhì)組水平篩選抗體非常有用。
大多數(shù)細(xì)菌系統(tǒng)也需要抗體在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)穩(wěn)定,，因為除了b-內(nèi)酰胺酶,，它們都參與細(xì)胞質(zhì)作用。盡管通過適當(dāng)突變和篩選可以顯著增加任何抗體的穩(wěn)定性,，但建立結(jié)合配基庫更適宜,。庫中多數(shù)結(jié)合配基在細(xì)胞內(nèi)條件下是有功能的，而不需要優(yōu)化單個scFvs,。這樣的庫還沒有建立起來,。最近的研究表明接上一個麥芽糖結(jié)合蛋白C端,，scFvs在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可以保持穩(wěn)定以及而且可以高水平表達(dá)。
使用b-內(nèi)酰胺酶實驗篩選抗原-抗體相互作用與DHFR類似,，不需要利用在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的抗體庫,，因為這種酶在外周胞質(zhì)具有活性。然而它需要抗原分泌到外周胞質(zhì),，細(xì)胞質(zhì)抗原在這些條件下是不穩(wěn)定的,。結(jié)果，遺傳篩選方法需要有幾種可行的方法,，這依賴于抗原特性,。親和篩選法也有同樣要求，這種方法將遺傳和物理篩選方法結(jié)合起來,，需要抗原和噬菌體抗體在外周胞質(zhì)共表達(dá),。在一輪傳統(tǒng)噬菌體展示選擇之后，抗原抗體在外周胞質(zhì)相互作用,，利用過濾法掃描陽性克隆,，這種技術(shù)已經(jīng)鑒定許多不同抗體。
目前有一些不同方法用于高通量篩選基因產(chǎn)物抗體,。決定那種方法適合特異基因組依賴于是否有純化的選擇因子（蛋白質(zhì)或片段）,。如果有物理篩選方法（噬菌體展示，酵母展示和核糖體展示）是非常適宜的,。如果缺乏純化的選擇因子,，可以使用多肽或者遺傳篩選方法，盡管兩個方法在技術(shù)成熟性和操作簡便性遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及物理篩選方法,。
-------------------
