王建偉 譯

吉林大學(xué)藥學(xué)院

蛋白質(zhì)組學(xué)是大規(guī)模的蛋白質(zhì)分析，它將極大地促成我們?cè)诤蠡蚪M時(shí)代對(duì)基因功能的理解,。蛋白質(zhì)組學(xué)能被分為3個(gè)主要領(lǐng)域：（1）針對(duì)大量蛋白質(zhì)鑒定的蛋白微觀(guān)特性學(xué),；（2）潛在的應(yīng)用于一大系列疾病的基于蛋白水平比較的"差異展示"蛋白質(zhì)組學(xué)；（3）用質(zhì)譜法或者酵母雙雜交等技術(shù)研究的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互關(guān)系學(xué),。因?yàn)榧词够诤推渌鞍淄葱曰蛘呱踔寥S結(jié)構(gòu)的比較,，也往往難于預(yù)測(cè)一個(gè)蛋白的功能，所以對(duì)一個(gè)蛋白復(fù)合物的成分或者細(xì)胞結(jié)構(gòu)的測(cè)定在功能分析中是重要的,。蛋白質(zhì)學(xué)在該方面的研究也許是大有希望的領(lǐng)域,。在分子生物學(xué)發(fā)生巨變后，例如通過(guò)DNA方法使克隆變得容易,，蛋白質(zhì)組學(xué)在未來(lái)幾年內(nèi)將增加我們對(duì)于蛋白質(zhì),、加工和路徑的生物化學(xué)的理解。

在很短時(shí)期內(nèi)大規(guī)模的DNA測(cè)序已經(jīng)使生物醫(yī)學(xué)的研究發(fā)生了變革,。隨著大多數(shù)人類(lèi)基因的發(fā)現(xiàn),，現(xiàn)在很明顯如果我們能夠得到對(duì)于復(fù)雜生物過(guò)程一個(gè)全面的了解，那么一個(gè)解決生物問(wèn)題的"工廠(chǎng)化方法"是值得要的,。在本篇中我們將回顧一下蛋白質(zhì)組學(xué)是如何通過(guò)對(duì)全球基因產(chǎn)品的分析,，來(lái)對(duì)我們理解生物學(xué)和醫(yī)學(xué)同樣地作出至關(guān)緊要的貢獻(xiàn)的,。

蛋白質(zhì)組學(xué)的定義
蛋白質(zhì)組學(xué)是大規(guī)模蛋白質(zhì)的研究，通常是利用生物化學(xué)的方法,。蛋白質(zhì)組學(xué)這個(gè)詞傳統(tǒng)上是和通過(guò)一個(gè)已知的細(xì)胞系或生物體在雙向聚丙烯酰胺凝膠上展示大量蛋白相關(guān)的1-4,。在這種意義上，蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)可以回溯到20世紀(jì)70年代末,，當(dāng)時(shí)研究者們開(kāi)始用當(dāng)時(shí)最新的發(fā)達(dá)技術(shù)雙向凝膠電泳技術(shù)來(lái)構(gòu)建蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)5（框1）,。這導(dǎo)致通過(guò)廣泛的編目雙向凝膠像點(diǎn)來(lái)對(duì)所有表達(dá)的蛋白建立數(shù)據(jù)庫(kù)。然而,，盡管當(dāng)時(shí)這樣的凝膠跑動(dòng)可以在實(shí)驗(yàn)室間再現(xiàn),，但是確定蛋白的身份是困難的，因?yàn)槿鄙賹?duì)于蛋白特性靈敏而快速的分析方法（例如聚合酶鏈反應(yīng)和自動(dòng)化的DNA分析的測(cè)序儀）,。在20世紀(jì)90年代,，生物的質(zhì)譜儀作為一個(gè)強(qiáng)大的分析方法誕生了，以至彌補(bǔ)了大多數(shù)蛋白質(zhì)分析的局限性,。這個(gè)發(fā)展,，加上在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中整個(gè)人類(lèi)編碼序列的實(shí)用性，標(biāo)志著一個(gè)新紀(jì)元的開(kāi)始,。如今,，蛋白質(zhì)組學(xué)這個(gè)術(shù)語(yǔ)涵蓋了多數(shù)基因產(chǎn)品的功能分析即功能基因組學(xué),，包括大規(guī)模的蛋白質(zhì)鑒定或定位研究以及用酵母雙雜交系統(tǒng)（yeast two-hybrid system）研究其相互作用,。然而，更為焦點(diǎn)的大規(guī)模的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究通常改為不包括和標(biāo)定"結(jié)構(gòu)基因組學(xué)"6,。同樣地,，僅僅靶向基因或mRNA的策略，例如大規(guī)模的突變或反義實(shí)驗(yàn),，是不應(yīng)該被考慮為蛋白質(zhì)組學(xué)的一部分的,。

蛋白質(zhì)組學(xué)的必要性
隨著數(shù)據(jù)庫(kù)中大量DNA序列的積累，研究者們意識(shí)到僅僅完成基因組的測(cè)序是不足以闡明生物的功能的,。一個(gè)細(xì)胞正常來(lái)說(shuō)是基于眾多的代謝和調(diào)節(jié)路徑來(lái)維持其生存的,。在細(xì)胞的基因和蛋白成分即蛋白質(zhì)組間沒(méi)有嚴(yán)格的線(xiàn)性關(guān)系。蛋白質(zhì)組學(xué)是基因組學(xué)的補(bǔ)充,，因?yàn)樗性诩?xì)胞中的活性因子：基因產(chǎn)品的研究,。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)直接導(dǎo)致了藥物發(fā)展,，因?yàn)閹缀跛械乃幬锸侵苯佣ㄏ虻鞍椎摹?br /> 基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中一個(gè)開(kāi)放讀碼框（open reading frame ,，ORF）的存在并不必要地意味著一個(gè)功能基因的存在。盡管生物信息學(xué)已飛速發(fā)展,，仍然難于從基因數(shù)據(jù)庫(kù)中精確地預(yù)測(cè)基因（見(jiàn)該期Eisenberg等的綜述,，823-826頁(yè),，和參考文獻(xiàn)7, 8）。雖然相關(guān)生物的測(cè)序通過(guò)比較基因組學(xué)將減輕基因預(yù)測(cè)的問(wèn)題,，但是初級(jí)結(jié)構(gòu)的正確預(yù)測(cè)的成功率仍低9,，10，特別是在小基因（小基因整個(gè)都能被忽視掉）或者那些與其它已知基因少有或沒(méi)有同源關(guān)系的基因中,。最近一項(xiàng)研究表明在對(duì)來(lái)自Mycoplasma genitalium 基因組的340個(gè)基因的注釋中,，錯(cuò)誤率至少為8％11。如果這樣的錯(cuò)誤率推斷到人類(lèi)基因組,，結(jié)果和推論是容易想象得到的,。因此，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)的方法確認(rèn)一個(gè)基因產(chǎn)物在"注釋基因組"這項(xiàng)工作中是重要的最初的一步,。蛋白質(zhì)的修飾顯然不是源于DNA序列,，例如異構(gòu)體和轉(zhuǎn)錄后修飾，這些修飾僅能被蛋白質(zhì)組學(xué)的方法論所測(cè)得,。此外,，也許有必要立即確定蛋白的表達(dá)水平，因?yàn)閙RNA水平和蛋白水平也許有或者沒(méi)有相關(guān)性12,，13,。基因產(chǎn)品的定位常常難以從序列來(lái)預(yù)測(cè),，卻可用實(shí)驗(yàn)的方法確定,。諸如細(xì)胞間通過(guò)蛋白質(zhì)水解、再生和隔離來(lái)調(diào)節(jié)蛋白功能等機(jī)制影響了基因產(chǎn)物而非基因本身,。最后,，蛋白和蛋白間作用以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分子成分如細(xì)胞器，僅能在蛋白水平測(cè)定到,。

蛋白質(zhì)的鑒定和分析
蛋白質(zhì)的制備方法
蛋白質(zhì)組學(xué)中最至關(guān)緊要的步驟之一是獲得和處理蛋白樣本,。與大約有100，000個(gè)基因的整個(gè)基因組不相稱(chēng)的是,，一個(gè)指定的細(xì)胞系也許可以表達(dá)約10,，000個(gè)基因并且更高的在組織中的表達(dá)。此外,，生物樣本內(nèi)動(dòng)態(tài)的蛋白質(zhì)充裕的范圍能達(dá)到106,。因?yàn)榧词棺詈玫碾p向凝膠能分解不多于1，000種蛋白,，所以顯然如果采用未加工的蛋白混合物,，那么只能含量最豐富的蛋白質(zhì)才能用凝膠電泳顯現(xiàn)出來(lái)。降低復(fù)雜性和差異性的理想解決方法是用基于親和力的利用整個(gè)蛋白質(zhì)組的蛋白純化方法,。例如,，中等豐裕度的促紅細(xì)胞生成素受體,，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)約存在1，000個(gè)拷貝,，或者每升細(xì)胞培養(yǎng)液中少于2皮摩爾（100ng）,。該蛋白不能從整個(gè)細(xì)胞抽取液中顯現(xiàn)出來(lái)，但能很容易通過(guò)抗體相關(guān)親和力純化法濃縮而產(chǎn)生一個(gè)銀染的帶子,。如果信號(hào)分子和其它調(diào)節(jié)分子要被研究的話(huà),，那么這個(gè)事實(shí)是必須要牢記的。
在得到蛋白碎片后,，選擇的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法是單向或雙向凝膠電泳法,。作為一個(gè)預(yù)備方法，單向電泳的優(yōu)點(diǎn)實(shí)質(zhì)上是所有的蛋白質(zhì)在SDS中是可溶的,，很容易覆蓋從10,，000到300，000范圍的相關(guān)分子量的蛋白,，而且極為酸性和堿性的蛋白容易被顯出,。

蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定
蛋白質(zhì)組學(xué)中意義最為重大的突破是凝膠分離后蛋白的質(zhì)譜檢測(cè)的出現(xiàn)，這極大地?cái)U(kuò)大了純粹的蛋白顯示分析,。質(zhì)譜已經(jīng)從本質(zhì)上取代了經(jīng)典的埃德曼降解技術(shù)甚至是在傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)化學(xué)中,，因?yàn)樗鼮殪`敏，能處理蛋白質(zhì)混合物并提供更高的生產(chǎn)量,。該法通過(guò)利用特異序列水解酶如胰蛋白酶,，來(lái)水解凝膠分離后的蛋白成肽段。之所以分析肽段而不是蛋白,，是因?yàn)槟z分離后的蛋白難以被洗脫和被質(zhì)譜分析,，并且蛋白的分子量通常不能滿(mǎn)足數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定的需要。相反,，肽段容易從凝膠上洗脫下來(lái)，并且即使來(lái)自蛋白的一小批的肽段也能提供足夠的用于鑒定的信息,。如圖1,，展示了一個(gè)與源于血小板的生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor ，PDGF）信號(hào)有關(guān)的分子的分析,。通過(guò)這個(gè)圖可以闡明這些步驟典型地與一個(gè)蛋白的質(zhì)譜分析有關(guān),。此外一個(gè)詳細(xì)的描述質(zhì)譜鑒定信號(hào)分子的方法和策略草案在參考14中能找到。
蛋白的質(zhì)譜鑒定有兩種主要方法,。在最初由Henzel及其合作者提出的"肽段質(zhì)譜圖"（peptide-mass mapping）方法中,，需要在質(zhì)譜法中對(duì)肽段混合物進(jìn)行預(yù)洗脫，這導(dǎo)致了致力于蛋白質(zhì)"肽段質(zhì)譜指紋"（peptide-mass fingerprint）的研究,。這種質(zhì)譜法是從一個(gè)相關(guān)的單一質(zhì)譜法--介質(zhì)輔助的激光解吸/離子化（matrix-assisted laser desorption/ionization ,，MALDI）中得到的,，該法導(dǎo)致一段混合肽段的發(fā)散飛行時(shí)間（框2和圖1b）。MALDI鑒定程序的自動(dòng)化有了發(fā)展,，由此數(shù)以百計(jì)的蛋白斑點(diǎn)能被切離,、酶法消化，所得到的質(zhì)譜能自動(dòng)地在數(shù)據(jù)庫(kù)中收索16,，17,。隨著數(shù)據(jù)庫(kù)中更多完整長(zhǎng)度的人類(lèi)基因的描繪，MALDI法所鑒定的成功率將更進(jìn)一步地提高,。
在一個(gè)對(duì)快速和確定的蛋白鑒別二步法中,，MALDI的指紋識(shí)別是第一步18。蛋白識(shí)別的第二種方法依靠肽段混合物中的單個(gè)肽段的碎裂片斷來(lái)得到序列信息,。在這個(gè)方法中,，肽段直接從液相中被"電噴霧離子化"（electrospray ionization）所電離。肽段離子被噴進(jìn)一個(gè)"串聯(lián)質(zhì)譜儀"（tandem mass spectrometer）中,。該質(zhì)譜儀能分解混合物中的肽段,，每次隔離一類(lèi)片斷然后分裂成以氨基或羧基結(jié)尾的片斷（圖1c）。串聯(lián)質(zhì)譜法在技術(shù)較MALDI指紋識(shí)別法更為復(fù)雜且不可升級(jí),。它主要的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)于一個(gè)蛋白的鑒別,，由幾個(gè)肽段得到的序列信息要比一列肽段集合得到的序列信息更為特異。碎裂片斷的數(shù)據(jù)不僅能用于搜索蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)還能用于核苷數(shù)據(jù)庫(kù)例如表達(dá)序列標(biāo)記（expressed sequence tag ,，EST）數(shù)據(jù)庫(kù),，甚至最近有用于天然的基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù) （B. Küster, P. Mortensen, J. S. Andersen 及 M. Mann，該數(shù)據(jù)尚未出版）,。

質(zhì)譜法的新發(fā)展
生物質(zhì)譜法仍在迅速的發(fā)展,，這要?dú)w功于在各個(gè)領(lǐng)域內(nèi)持續(xù)的技術(shù)發(fā)展。例如,，一種MALDI離子源和高效串聯(lián)質(zhì)譜儀聯(lián)用的新型質(zhì)譜儀最近已經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái),，它能打碎獨(dú)特的肽段19。假如這個(gè)MALDI使飛行時(shí)間增加3倍的裝置被證明是足夠靈敏的話(huà),，那么它將使高產(chǎn)量的肽段繪圖法和特異性的肽段測(cè)序法聯(lián)用起來(lái),，從而用一步法代替原來(lái)的二步法質(zhì)譜分析策略。以我們的經(jīng)驗(yàn),，這套裝置已經(jīng)有效地增強(qiáng)了小蛋白的分析能力提高了分析簡(jiǎn)單蛋白混合物時(shí)的產(chǎn)量,。在利用微型人造芯片使蛋白質(zhì)小型化的準(zhǔn)備中，成就也是有的,，在此已經(jīng)得到了有前途的結(jié)果20-22,。然而，這些方法仍沒(méi)有產(chǎn)生出利用標(biāo)準(zhǔn)試管或微量滴定板形式預(yù)備的靈敏度或穩(wěn)定度,。用MALDI質(zhì)譜法直接掃描單向或雙向凝膠仍然需要長(zhǎng)時(shí)間的精力,。最近一個(gè)變化是在電泳轉(zhuǎn)移到一個(gè)收集膜時(shí)利用一個(gè)插入的隔膜,，隔膜包括固定不動(dòng)的用于降解蛋白質(zhì)的胰蛋白酶。然后這個(gè)膜通過(guò)MALDI產(chǎn)生出的一個(gè)針對(duì)每個(gè)凝膠定位的肽段圖來(lái)光柵化而被分析,。
在未來(lái),，值得直接通過(guò)質(zhì)譜法來(lái)分析一個(gè)蛋白樣本，而不用凝膠分離或酶解,。Smith等把天然的蛋白提取物裝進(jìn)一個(gè)毛細(xì)管然后利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)通過(guò)毛細(xì)管電泳來(lái)分離蛋白27,。被分離的蛋白然后直接被注入到一個(gè)專(zhuān)門(mén)的傅立葉變換離子回旋共振（FTICR）質(zhì)譜儀中（圖2），然后數(shù)以百計(jì)的精確的蛋白質(zhì)分子量在一個(gè)單一跑動(dòng)即可得到,。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中,，集中的發(fā)布趨向于小蛋白，而且僅是大多數(shù)的而不是同一的蛋白能被確定,。但是在未來(lái)也許有可能用這種策略通過(guò)在線(xiàn)的蛋白碎裂片斷來(lái)鑒定蛋白28-29,。這將使研究者們?cè)谝粋€(gè)單一的自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)內(nèi)可以完成整個(gè)蛋白質(zhì)組的分析，這種方法至少對(duì)于中等豐度的可溶性蛋白這個(gè)子集來(lái)說(shuō)是可以的,。

翻譯后修飾
蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)獨(dú)特性是分析蛋白翻譯后修飾的功能,。磷酸化、糖基化和硫酸化還有許多其它的修飾對(duì)蛋白的功能是極為重要的,，因?yàn)樗鼈兡軟Q定蛋白的活性,、穩(wěn)定性、定位和循環(huán),。這些修飾顯然通常不是來(lái)自基因組序列或者mRNA表達(dá)的數(shù)據(jù),。然而質(zhì)譜法是精選的蛋白質(zhì)組學(xué)方法來(lái)確定蛋白質(zhì)的修飾，這項(xiàng)工作比純粹的蛋白特性的確定要困難的多,。最小限度的數(shù)據(jù)--經(jīng)常少至一兩個(gè)肽段需要被成片斷化,，已經(jīng)足夠鑒別序列數(shù)據(jù)庫(kù)里的蛋白質(zhì)。然而,，為了得到翻譯后修飾的種類(lèi)和位置,，所有沒(méi)有達(dá)到預(yù)期分子量的肽段需要進(jìn)一步的分析。由于種種原因,，較之蛋白質(zhì)識(shí)別來(lái)說(shuō),，更多的材料需要被用來(lái)研究翻譯后修飾。在該領(lǐng)域中已經(jīng)有了持續(xù)的進(jìn)展,，特別是在磷酸化事件中。磷酸化事件能用普通的策略研究,，因?yàn)榱姿峄碾亩我任幢恍揎椷^(guò)的重80Da,，從而能引起一個(gè)特殊的質(zhì)譜片斷（PO3-，質(zhì)量79）,。磷酸化的肽段能吸附到金屬樹(shù)脂上,，能被特異的抗體識(shí)別而且磷酸基團(tuán)能被磷酸酶去除掉30-34,。例如：圖1顯示了依據(jù)基于金屬樹(shù)脂吸附的微凈化和磷酸酶處理的磷酸化肽段的探測(cè)。

磷酸化作用和信號(hào)途徑
個(gè)別受體介導(dǎo)的信號(hào)途徑導(dǎo)致一大批的酶作用底物發(fā)生酪氨酸磷酸化作用,。為了鑒別這些底物,，沒(méi)受刺激的和受生長(zhǎng)因子刺激的細(xì)胞的溶菌液能被雙向凝膠特殊處理而分解。所關(guān)心的蛋白能被32P標(biāo)記物所探測(cè)到,，或者可以用帶僅能識(shí)別活性態(tài)分子的抗體的western-blotting來(lái)探測(cè)（例如特異的磷酸化的酪氨酸或磷酸化的絲氨酸抗體）,。最近證明這些斑點(diǎn)然后能被質(zhì)譜所鑒別35。然而有一個(gè)更好的替代方法：首先利用質(zhì)譜鑒定,，在免疫沉淀步驟用抗磷酸化酪氨酸的抗體來(lái)濃縮這些底物,。在關(guān)于表皮生長(zhǎng)因子（EGF）受體途徑這樣一個(gè)研究中，幾個(gè)已知的和新的成分最近被報(bào)道了36,。

差異展示蛋白質(zhì)組學(xué)
雙向凝膠法
直到現(xiàn)在,，蛋白質(zhì)組學(xué)與雙向凝膠電泳法幾乎是同義的。比較雙向凝膠法在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,，其目的通常是識(shí)別那些在特異疾病中用于診斷標(biāo)識(shí)物或治療對(duì)象的高度規(guī)則或低度規(guī)則的蛋白質(zhì),。在這些實(shí)驗(yàn)中要面臨幾個(gè)技術(shù)性的挑戰(zhàn)。首先,，疏水的和大的蛋白通常不通過(guò)凝膠的第二走向,。其次，動(dòng)態(tài)分布的流動(dòng)使得幾乎最為豐裕的蛋白質(zhì)難以顯現(xiàn)出,。特別是在體內(nèi)流體,，象血漿和腦脊液，超過(guò)99％的蛋白完全是由血清蛋白和球蛋白組成的,。再次,，由于生物學(xué)的突變?cè)谶@些樣本中遺傳下來(lái)了，所以很難定義與疾病狀態(tài)下相對(duì)應(yīng)的正常的蛋白表達(dá)模式,。就這些應(yīng)用中的幾個(gè)而言,，基于陣列的mRNA表達(dá)其氨基酸組成的方法不僅能更為廣泛（因?yàn)樗麄兲峁┝擞糜谛酒乃谢蛏系臄?shù)據(jù)），而起更快,、更方便,。這已被許多研究所揭示（參見(jiàn)該期由Lockhart 和 Winzeler寫(xiě)的綜述，827-836頁(yè),，以及參考文獻(xiàn)37-40）,。
盡管有這些比較雙向凝膠法模式存在的困難，一些應(yīng)用仍然再一些著作中出現(xiàn)了,。例如,，Celis和她的合作者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)公認(rèn)的尿標(biāo)記物--牛皮癬素--能被用來(lái)追蹤調(diào)查患有膀胱鱗狀細(xì)胞癌的病人41。當(dāng)用來(lái)自正常組織分泌的蛋白和來(lái)自癌組織的蛋白進(jìn)行比較的時(shí)候，這個(gè)標(biāo)記物就能被識(shí)別到,。一個(gè)類(lèi)似的研究比較了利用免疫純化的細(xì)胞群得到的正常人類(lèi)腔狀和肌上皮的乳腺細(xì)胞的蛋白質(zhì)組,。該研究探測(cè)了170個(gè)蛋白點(diǎn)陣（是雙重差異表達(dá)的結(jié)果），其中51個(gè)是確定的,。然而幾乎所有的這些蛋白是大量的細(xì)胞骨架蛋白,，如肌動(dòng)蛋白和角蛋白。最近一項(xiàng)研究比較了兩種來(lái)自不同血統(tǒng)的小鼠中提取到的腦髓片斷的蛋白質(zhì)補(bǔ)體43,，發(fā)現(xiàn)超過(guò)1,，000個(gè)能遺傳的突變蛋白的點(diǎn)陣。如此研究在其它位置也許有用,，例如在野生型和基因敲除型小鼠的蛋白質(zhì)組的比較中,。毒理學(xué)研究經(jīng)常用蛋白質(zhì)組的分析來(lái)理解藥物作用機(jī)制或確定藥物作用的靶部位。當(dāng)比較對(duì)腎毒性缺乏免疫力或者有抵抗力的腎臟樣本時(shí),，Aicher和同事們發(fā)現(xiàn)鈣黏蛋白（鈣黏素－D,，28K）水平下降與環(huán)孢霉素A引導(dǎo)的腎毒性有關(guān)44。
當(dāng)雙向凝膠法作為一種分離某種定性的蛋白亞類(lèi)的方法和作為反對(duì)整個(gè)細(xì)胞比較制備法時(shí),，或者當(dāng)免疫學(xué)的方法用來(lái)使某蛋白亞類(lèi)顯露出時(shí),，生物學(xué)上的有關(guān)問(wèn)題就更容易解決了。如許多分泌蛋白能用雙向凝膠法分析細(xì)胞系的上清液和腫瘤組織的移植物而被識(shí)別45,。幾個(gè)研究團(tuán)體已經(jīng)用來(lái)自患過(guò)敏癥病人體內(nèi)的抗體,，探測(cè)到了來(lái)自引起過(guò)敏癥的生物體內(nèi)的雙向凝膠蛋白46，47,。用合理的預(yù)防和治療策略的設(shè)計(jì)方法可以開(kāi)發(fā)一個(gè)通過(guò)質(zhì)譜法識(shí)別過(guò)敏源的方法,。
我們預(yù)測(cè)蛋白表達(dá)分析在良好定義的區(qū)域內(nèi)將最為有用，如（1）不含mRNA的樣本的分析,，如某些體內(nèi)流體的分析,；（2）蛋白發(fā)豐度和mRNA的豐度不相關(guān)的情況下；（3）涉及蛋白翻譯后修飾（如糖基化或磷酸化）的關(guān)鍵變化而非蛋白豐度的變化的情況下,；（4）全面描述最為豐裕的特殊來(lái)源的蛋白,，其本身是重要的情況下；（5）雙向凝膠允許相關(guān)地全面描述一個(gè)簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)組樣本（如對(duì)于微生物的描述）的情況下,。

蛋白質(zhì)芯片
在蛋白質(zhì)芯片方法中,，許多"誘餌"蛋白如抗體，能以陣列的格式被固定在特殊處理的物體表面上（圖4）,。然后其表面用感興趣的樣本探測(cè),，而且只有那些能與相關(guān)抗體吸附的蛋白能繼續(xù)吸附在芯片上48。這種方法本質(zhì)上是已用于臨床診斷的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的一個(gè)大型版,。在某個(gè)版本中,，用來(lái)自?xún)煞N不同期細(xì)胞的熒光標(biāo)記的蛋白探測(cè)蛋白質(zhì)芯片,。細(xì)胞裂解液用不同熒光標(biāo)記然后混合,，其顯色效果顯示了附著在抗體上的蛋白質(zhì)的豐度發(fā)生變化的信息,。這個(gè)系統(tǒng)取決于相當(dāng)特異的且特征性很好的抗體，而且許多技術(shù)問(wèn)題仍需克服,。然而,，一旦該系統(tǒng)完善，它將提供便利的蛋白質(zhì)組分析,。在其它蛋白修飾中,，隨著粘合物的發(fā)現(xiàn)，肽段,、蛋白質(zhì)片斷或蛋白質(zhì)也許也能固定到芯片和樣本（如抗生素庫(kù)或病人血清）上來(lái)應(yīng)用于芯片技術(shù),。一種用蛋白質(zhì)芯片的方法結(jié)把以上的技術(shù)與一個(gè)直接的具有吸附材料的MALDI讀出器結(jié)合起來(lái)。

通過(guò)質(zhì)譜法定量
除了以上的方法,，差異展示蛋白質(zhì)組學(xué)也能通過(guò)質(zhì)譜定量法用有限的或不用蛋白片斷來(lái)完成,。因?yàn)橘|(zhì)譜圖中的一個(gè)肽峰的強(qiáng)度是無(wú)法預(yù)測(cè)的，所有定量要通過(guò)穩(wěn)定同位素標(biāo)記的兩個(gè)狀態(tài)之一來(lái)完成,。這種方法已被用于傳統(tǒng)的小分子的質(zhì)譜測(cè)定法中,，但是最近才被用到蛋白質(zhì)組學(xué)上。細(xì)菌的生長(zhǎng),，例如在普通培養(yǎng)基中生長(zhǎng)是一種狀態(tài),，在僅含N15而不含N14的培養(yǎng)基中又是一種狀態(tài)。來(lái)自?xún)煞N狀態(tài)的的蛋白制備物然后被混合,、分離和用質(zhì)譜分析,。任何肽段的兩種翻譯現(xiàn)在能被探測(cè)到。 其中一個(gè)在質(zhì)譜中通過(guò)氮原子的數(shù)量而顯得較強(qiáng)而且峰高的比值精確地量化了相應(yīng)蛋白的相對(duì)數(shù)量,。作為另外一種可選方法,，Aebersold和他的同事們?cè)谫|(zhì)譜法定量樣本前，引進(jìn)一個(gè)非放射性同位素標(biāo)記物標(biāo)記了細(xì)胞裂解后的半胱氨酸51,。這種策略使得那些沒(méi)經(jīng)過(guò)凝膠電泳的極為天然的蛋白混合物中最為豐裕的肽段能被定量,。

蛋白和蛋白間的作用
除了蛋白質(zhì)被表達(dá)的時(shí)間、位置以外,，一個(gè)關(guān)于蛋白質(zhì)的關(guān)鍵問(wèn)題是它和其它哪些蛋白質(zhì)相互作用,。相互作用的伴侶是可以立即直接引起生物學(xué)功能而且有可能因其治療目的而被開(kāi)發(fā)。細(xì)胞的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用圖的產(chǎn)生對(duì)理解細(xì)胞的生物學(xué)內(nèi)容有著巨大的價(jià)值,。

蛋白質(zhì)復(fù)合物的純化
蛋白質(zhì)組學(xué)能對(duì)蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)的相互作用的研究做出關(guān)鍵性的貢獻(xiàn)52-55,。一個(gè)研究蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的誘人的方法是通過(guò)基于親和力的方法純化這個(gè)完整的多蛋白復(fù)合體。這可以通過(guò)多種方法達(dá)到,，比如：用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）-融合蛋白,、抗體、肽、DNA,、RNA或是用一個(gè)特異吸附到細(xì)胞靶部位的小分子,。與新蛋白質(zhì)相互作用的伴侶的普通識(shí)別方法之一是用抗原決定簇標(biāo)記它。然后這個(gè)蛋白質(zhì)和與其相互作用的伴侶一起能在細(xì)胞里被過(guò)渡表達(dá),。而且這個(gè)蛋白質(zhì)能通過(guò)一個(gè)抗抗原決定簇的抗體發(fā)生免疫沉淀反應(yīng),。這只需要這個(gè)基因的足夠長(zhǎng)的互補(bǔ)DNA克隆，而且不用花時(shí)間用來(lái)產(chǎn)生一個(gè)針對(duì)感興趣的基因的沉淀抗體,。因?yàn)樽銐蜷L(zhǎng)的cDNAs也許不久就可用于多數(shù)人類(lèi)基因56,，所以大規(guī)模的相互作用的研究將有可能進(jìn)行。制作融合蛋白如GST-融合法,是另一個(gè)獲得相互作用伴侶的一般方法（圖5）,。這個(gè)多蛋白復(fù)合物和"誘餌"聯(lián)合,，這個(gè)誘餌被固定在一個(gè)載體上。洗掉那些非特異性作用的蛋白后,，這個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合物被洗提,、被凝膠電泳分離，然后用質(zhì)譜分析,。因此在一個(gè)單一的試驗(yàn)里,，整個(gè)多蛋白復(fù)合物的成分能被鑒定出。例如,，人的接合體作為結(jié)合復(fù)合物?quot;誘餌",，已通過(guò)用生物素化作用的RNA純化到57。它的蛋白質(zhì)成分然后被用雙向凝膠電泳展示出來(lái)（圖6a）,。從單一的雙向凝膠中有19個(gè)新因子被得到了（大多數(shù)在EST數(shù)據(jù)庫(kù)中）,。他們中的一些被克隆和進(jìn)一步分析了。用新蛋白和復(fù)合物內(nèi)的其它成分的免疫熒光檢驗(yàn)法得到的共同定位,，被用于固定那些是復(fù)合物真正的成分（圖6b）,。一些從這個(gè)研究中鑒別出的新因子被克隆和用GST-融合蛋白法生成了。用圖5里所示的策略,，這些蛋白質(zhì)中的一個(gè)被命名為S14的蛋白,，沉淀了一系列接合體蛋白（圖6c），這結(jié)合其它實(shí)驗(yàn)及序列的生物信息學(xué)分析,，顯示這個(gè)蛋白的一項(xiàng)功能?，F(xiàn)在用以上略述的策略已經(jīng)定性了許多蛋白復(fù)合物。其中一些復(fù)合物含有酵母Arp2/3復(fù)合物58,，該復(fù)合物是在酵母的核－孔復(fù)合體中發(fā)現(xiàn)的和能結(jié)合分子伴侶GroEL的蛋白復(fù)合物60,。
這些研究洞穿了作用機(jī)制并且啟動(dòng)了一系列新的調(diào)查研究。因?yàn)闆](méi)有關(guān)于復(fù)合物的假設(shè),，細(xì)胞作用之間不可置疑的因果關(guān)系例行公事地出現(xiàn)了,。例如：一個(gè)在小鼠大腦的抑制蛋白-Ⅰ和抑制蛋白-Ⅱ結(jié)合蛋白的研究導(dǎo)致了兩套蛋白的發(fā)現(xiàn),，一個(gè)是由控制調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的信號(hào)分子組成，另一個(gè)與細(xì)胞的內(nèi)吞作用密切相關(guān),。這個(gè)顯示了信號(hào)轉(zhuǎn)換途徑和包括抑制蛋白的微絲組裝間存在聯(lián)結(jié)61,。
一旦多蛋白聯(lián)合體的成分被質(zhì)譜分析所確定，他們的功能就會(huì)被有關(guān)的化驗(yàn)研究,。在這個(gè)發(fā)展階段,，蛋白質(zhì)組學(xué)作為一個(gè)重復(fù)方式被用來(lái)定義與復(fù)合物中新蛋白質(zhì)直接相互作用的伴侶，并且/或者在細(xì)胞里和其它的復(fù)合物相連接62,。
以上提到的策略的成功依賴(lài)于蛋白復(fù)合物與誘餌充分的親和力，以及為了純化步驟而需要的最優(yōu)化的條件,。例如：雙標(biāo)記策略的應(yīng)用提高了復(fù)合物的回收和減少了非特異性蛋白的結(jié)合63,。低親和力的相互作用的蛋白在親和純化前能潛在的被化學(xué)交聯(lián)的蛋白質(zhì)復(fù)合物所捕獲，因?yàn)樗蕾?lài)于空間的接近而不是親和力,。交聯(lián)也能通過(guò)確定最接近的蛋白來(lái)幫助闡明蛋白質(zhì)復(fù)合物的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)64,。
特殊的細(xì)胞器官的成分也開(kāi)始被分析了。酵母的高爾基體已被編目,，而且為了確定參與光和作用復(fù)合物處理,，靶向，插入和組裝的蛋白質(zhì),，豌豆的葉綠體的成分也被類(lèi)似地研究了65,，66。通過(guò)分析從完整的樣品溶液中消化獲得的天然的肽混合物,，染色質(zhì)間的顆粒已經(jīng)被檢驗(yàn)分析了67,。

酵母雙雜交系統(tǒng)
酵母雙雜交系統(tǒng)是作為一個(gè)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的強(qiáng)大的工具出現(xiàn)的68。他是一個(gè)基于轉(zhuǎn)錄因子模塊結(jié)構(gòu)的遺傳學(xué)方法,，這個(gè)因子在DNA結(jié)合區(qū)與引起一套基因的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)的活化區(qū)緊密結(jié)合的部位,。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)是被酵母細(xì)胞核里相互作用的兩個(gè)ORFs所編碼時(shí)，酵母雙雜交系統(tǒng)是用融合到GAL4 的DNA的結(jié)合區(qū)（DNA binding domain,，DNA-BD）或轉(zhuǎn)錄激活區(qū)（DNA activation domain,，DNA-AD）的ORFs來(lái)增強(qiáng)一個(gè)通訊基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)果。它的一個(gè)主要結(jié)果是一旦一個(gè)陽(yáng)性的相互作用被發(fā)現(xiàn),，僅僅通過(guò)測(cè)序相關(guān)的克隆就能確定ORF,。因?yàn)檫@些原因，它是一種普通的方法,，它簡(jiǎn)單而且很適于作為高通量的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的篩選法,。
在大的規(guī)模上，這個(gè)策略以?xún)煞N形式使用,。在陣列法里,，包含了作為DNA融合物或激活區(qū)的ORFs的酵母菌株,，被排列在一個(gè)格子上；然后要被檢驗(yàn)的ORFs（作為互補(bǔ)的融合物）在整個(gè)格子里被篩選以確定能相互作用的菌株（圖4）,。在庫(kù)篩選法里,，一套ORFs首先總體合并產(chǎn)生一個(gè)庫(kù)，然后互補(bǔ)的ORF融合物和這個(gè)庫(kù)一個(gè)接一個(gè)地或幾個(gè)同時(shí)發(fā)生配對(duì)（圖7c）,。
在基因組層面上的這種分析已經(jīng)在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 中被報(bào)道過(guò)了,，而且在canorhabditis elegans中到了更限制的程度。在酵母中,，陣列法被應(yīng)用在192個(gè)ORF,，庫(kù)篩選法完成了對(duì)87％的酵母基因組的測(cè)定。結(jié)合起來(lái),，這個(gè)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了957個(gè)假定的相互作用70,。另一組分析了酵母中10％詳盡的庫(kù)篩選的結(jié)果，產(chǎn)生了183個(gè)假定的相互作用71,。在這兩個(gè)大規(guī)模的研究中發(fā)現(xiàn)的相互作用的大多數(shù)是新的,。這些相互作用中的一些憑借早先的遺傳學(xué)或是生化學(xué)的研究看似乎是合理的，然而大多數(shù)其它的關(guān)聯(lián)不能很容易地確定,。因此,，這個(gè)研究?jī)H僅提供了可能的相互作用，這些可能的相互作用必須被進(jìn)一步的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)確定或是排除,。這些方法主要的優(yōu)點(diǎn)是他們可以高產(chǎn)量而且是自動(dòng)化的樣式完成,。一個(gè)最近所描述的酵母雙雜交方法的改良，術(shù)語(yǔ)叫"逆轉(zhuǎn)"雙雜交,，可用來(lái)鑒定能使蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用中斷的復(fù)合物和肽段72,。這個(gè)可以指導(dǎo)在體內(nèi)具有活性的藥物的開(kāi)發(fā)，與這相反傳統(tǒng)的藥物篩選是在體外進(jìn)行的,。

噬菌體展示技術(shù)
噬菌體展示技術(shù)是一種用噬菌體表達(dá)肽或是表達(dá)融合到衣殼/外殼蛋白上的所感興趣的蛋白質(zhì)的技術(shù),。它可以被用來(lái)篩選肽的抗原決定簇，肽的配合基,，酶作用底物或是單鏈抗體片斷,。盡管組合肽庫(kù)逐漸被應(yīng)用在大多數(shù)的以噬菌體展示為基礎(chǔ)的研究中，但是假如這個(gè)cDNA庫(kù)的產(chǎn)物被展示在噬菌體顆粒上,，那么更多信息豐富的大規(guī)模的蛋白質(zhì)相互作用的研究就可以進(jìn)行了,。任何一個(gè)"誘餌"蛋白可以被固定而捕獲顯示相互作用蛋白的噬菌體顆粒。這個(gè)方法在簡(jiǎn)單性和高產(chǎn)量方面,，與酵母雙雜交系統(tǒng)有些相似,。依賴(lài)所研究的特殊類(lèi)型的蛋白質(zhì)（例如細(xì)胞質(zhì)對(duì)細(xì)胞表面蛋白），這個(gè)方法可能優(yōu)于或是不如雙雜交系統(tǒng),，因?yàn)槠湎嗷プ饔冒l(fā)生在溶液中而非酵母細(xì)胞核里,。此外,，這個(gè)方法原則上適用于不能用酵母雙雜交系統(tǒng)處理的轉(zhuǎn)錄因子。為了在噬菌體上展示cDNA庫(kù)來(lái)分離在EGF-受體信號(hào)途徑上的信號(hào)分子,，同時(shí)也為了確定和特定抗體反應(yīng)的抗原,，方法最近被完善了73，74,。

結(jié)論
為了直接在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行大規(guī)?；蚬δ艿难芯浚鞍踪|(zhì)組學(xué)提供了一套強(qiáng)大的工具,。尤其是,，凝膠分離后的蛋白質(zhì)的質(zhì)譜研究正在導(dǎo)致一場(chǎng)用生化方法研究蛋白質(zhì)功能的復(fù)興。蛋白質(zhì)的特性描述將繼續(xù)在產(chǎn)量,、敏感性,、和完整性上提高改善。翻譯后修飾當(dāng)前不能在高產(chǎn)量下研究,，但是某些種類(lèi)如磷酸化開(kāi)始能用一般方法處理了。我們預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)組學(xué)將不再是用雙向凝膠電泳監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá),?；谫|(zhì)譜分析的方法的重要性將繼續(xù)增強(qiáng)，該方法采用以單向凝膠電泳指導(dǎo)的親和層析,。在不久的以后,，蛋白質(zhì)組學(xué)將提供出大量的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)，這可能是它在生物科學(xué)上最重要和最直接的影響,。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)比基因更接近功能,，這些研究常常直接導(dǎo)致生物學(xué)的發(fā)現(xiàn)或假說(shuō)。作為全部克隆的許多人類(lèi)基因的現(xiàn)成可用性,，其本身是基因組計(jì)劃的極為重要的擴(kuò)展,，這將使幾個(gè)蛋白質(zhì)組策略變?yōu)榭赡堋Ｓ眉兓鞍踪|(zhì)的方法作為確定蛋白質(zhì)功能的化驗(yàn)將對(duì)成千的蛋白質(zhì)自動(dòng)地以小型化格子的形式平行地執(zhí)行,。最后,，基因組學(xué)的進(jìn)展將直接促進(jìn)大規(guī)模的用遺傳學(xué)作為表達(dá)方法的蛋白質(zhì)化驗(yàn)，就像雙雜交篩選一樣,。