王建偉 譯
吉林大學藥學院
蛋白質(zhì)組學是大規(guī)模的蛋白質(zhì)分析,，它將極大地促成我們在后基因組時代對基因功能的理解。蛋白質(zhì)組學能被分為3個主要領(lǐng)域：（1）針對大量蛋白質(zhì)鑒定的蛋白微觀特性學,；（2）潛在的應用于一大系列疾病的基于蛋白水平比較的"差異展示"蛋白質(zhì)組學；（3）用質(zhì)譜法或者酵母雙雜交等技術(shù)研究的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互關(guān)系學,。因為即使基于和其它蛋白同源性或者甚至三維結(jié)構(gòu)的比較,，也往往難于預測一個蛋白的功能，所以對一個蛋白復合物的成分或者細胞結(jié)構(gòu)的測定在功能分析中是重要的,。蛋白質(zhì)學在該方面的研究也許是大有希望的領(lǐng)域,。在分子生物學發(fā)生巨變后，例如通過DNA方法使克隆變得容易,，蛋白質(zhì)組學在未來幾年內(nèi)將增加我們對于蛋白質(zhì),、加工和路徑的生物化學的理解。
在很短時期內(nèi)大規(guī)模的DNA測序已經(jīng)使生物醫(yī)學的研究發(fā)生了變革,。隨著大多數(shù)人類基因的發(fā)現(xiàn),，現(xiàn)在很明顯如果我們能夠得到對于復雜生物過程一個全面的了解，那么一個解決生物問題的"工廠化方法"是值得要的。在本篇中我們將回顧一下蛋白質(zhì)組學是如何通過對全球基因產(chǎn)品的分析,，來對我們理解生物學和醫(yī)學同樣地作出至關(guān)緊要的貢獻的,。
蛋白質(zhì)組學的定義
蛋白質(zhì)組學是大規(guī)模蛋白質(zhì)的研究，通常是利用生物化學的方法,。蛋白質(zhì)組學這個詞傳統(tǒng)上是和通過一個已知的細胞系或生物體在雙向聚丙烯酰胺凝膠上展示大量蛋白相關(guān)的1-4。在這種意義上,，蛋白質(zhì)組學已經(jīng)可以回溯到20世紀70年代末,，當時研究者們開始用當時最新的發(fā)達技術(shù)雙向凝膠電泳技術(shù)來構(gòu)建蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫5（框1）。這導致通過廣泛的編目雙向凝膠像點來對所有表達的蛋白建立數(shù)據(jù)庫,。然而,，盡管當時這樣的凝膠跑動可以在實驗室間再現(xiàn)，但是確定蛋白的身份是困難的,，因為缺少對于蛋白特性靈敏而快速的分析方法（例如聚合酶鏈反應和自動化的DNA分析的測序儀）,。在20世紀90年代，生物的質(zhì)譜儀作為一個強大的分析方法誕生了,，以至彌補了大多數(shù)蛋白質(zhì)分析的局限性,。這個發(fā)展，加上在公共數(shù)據(jù)庫中整個人類編碼序列的實用性,，標志著一個新紀元的開始,。如今，蛋白質(zhì)組學這個術(shù)語涵蓋了多數(shù)基因產(chǎn)品的功能分析即功能基因組學,，包括大規(guī)模的蛋白質(zhì)鑒定或定位研究以及用酵母雙雜交系統(tǒng)（yeast two-hybrid system）研究其相互作用,。然而，更為焦點的大規(guī)模的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究通常改為不包括和標定"結(jié)構(gòu)基因組學"6,。同樣地,，僅僅靶向基因或mRNA的策略，例如大規(guī)模的突變或反義實驗,，是不應該被考慮為蛋白質(zhì)組學的一部分的,。
蛋白質(zhì)組學的必要性
隨著數(shù)據(jù)庫中大量DNA序列的積累，研究者們意識到僅僅完成基因組的測序是不足以闡明生物的功能的,。一個細胞正常來說是基于眾多的代謝和調(diào)節(jié)路徑來維持其生存的,。在細胞的基因和蛋白成分即蛋白質(zhì)組間沒有嚴格的線性關(guān)系。蛋白質(zhì)組學是基因組學的補充,，因為它集中在細胞中的活性因子：基因產(chǎn)品的研究,。因此，蛋白質(zhì)組學直接導致了藥物發(fā)展,，因為幾乎所有的藥物是直接定向蛋白的,。
基因組數(shù)據(jù)庫中一個開放讀碼框（open reading frame ，ORF）的存在并不必要地意味著一個功能基因的存在。盡管生物信息學已飛速發(fā)展,，仍然難于從基因數(shù)據(jù)庫中精確地預測基因（見該期Eisenberg等的綜述,，823-826頁，和參考文獻7, 8）,。雖然相關(guān)生物的測序通過比較基因組學將減輕基因預測的問題,，但是初級結(jié)構(gòu)的正確預測的成功率仍低9，10,，特別是在小基因（小基因整個都能被忽視掉）或者那些與其它已知基因少有或沒有同源關(guān)系的基因中,。最近一項研究表明在對來自Mycoplasma genitalium 基因組的340個基因的注釋中，錯誤率至少為8％11,。如果這樣的錯誤率推斷到人類基因組,，結(jié)果和推論是容易想象得到的。因此,，通過蛋白質(zhì)組學的方法確認一個基因產(chǎn)物在"注釋基因組"這項工作中是重要的最初的一步,。蛋白質(zhì)的修飾顯然不是源于DNA序列，例如異構(gòu)體和轉(zhuǎn)錄后修飾,，這些修飾僅能被蛋白質(zhì)組學的方法論所測得,。此外，也許有必要立即確定蛋白的表達水平,，因為mRNA水平和蛋白水平也許有或者沒有相關(guān)性12,，13?；虍a(chǎn)品的定位常常難以從序列來預測,，卻可用實驗的方法確定。諸如細胞間通過蛋白質(zhì)水解,、再生和隔離來調(diào)節(jié)蛋白功能等機制影響了基因產(chǎn)物而非基因本身,。最后，蛋白和蛋白間作用以及細胞結(jié)構(gòu)的分子成分如細胞器,，僅能在蛋白水平測定到,。
蛋白質(zhì)的鑒定和分析
蛋白質(zhì)的制備方法
蛋白質(zhì)組學中最至關(guān)緊要的步驟之一是獲得和處理蛋白樣本。與大約有100,，000個基因的整個基因組不相稱的是,，一個指定的細胞系也許可以表達約10，000個基因并且更高的在組織中的表達,。此外,，生物樣本內(nèi)動態(tài)的蛋白質(zhì)充裕的范圍能達到106。因為即使最好的雙向凝膠能分解不多于1,，000種蛋白,，所以顯然如果采用未加工的蛋白混合物,，那么只能含量最豐富的蛋白質(zhì)才能用凝膠電泳顯現(xiàn)出來。降低復雜性和差異性的理想解決方法是用基于親和力的利用整個蛋白質(zhì)組的蛋白純化方法,。例如,，中等豐裕度的促紅細胞生成素受體，每個細胞內(nèi)約存在1,，000個拷貝,，或者每升細胞培養(yǎng)液中少于2皮摩爾（100ng）。該蛋白不能從整個細胞抽取液中顯現(xiàn)出來,，但能很容易通過抗體相關(guān)親和力純化法濃縮而產(chǎn)生一個銀染的帶子,。如果信號分子和其它調(diào)節(jié)分子要被研究的話，那么這個事實是必須要牢記的,。
在得到蛋白碎片后,，選擇的蛋白質(zhì)組學研究方法是單向或雙向凝膠電泳法,。作為一個預備方法,，單向電泳的優(yōu)點實質(zhì)上是所有的蛋白質(zhì)在SDS中是可溶的，很容易覆蓋從10,，000到300,，000范圍的相關(guān)分子量的蛋白，而且極為酸性和堿性的蛋白容易被顯出,。
蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定
蛋白質(zhì)組學中意義最為重大的突破是凝膠分離后蛋白的質(zhì)譜檢測的出現(xiàn),，這極大地擴大了純粹的蛋白顯示分析。質(zhì)譜已經(jīng)從本質(zhì)上取代了經(jīng)典的埃德曼降解技術(shù)甚至是在傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)化學中,，因為它更為靈敏,，能處理蛋白質(zhì)混合物并提供更高的生產(chǎn)量。該法通過利用特異序列水解酶如胰蛋白酶,，來水解凝膠分離后的蛋白成肽段,。之所以分析肽段而不是蛋白，是因為凝膠分離后的蛋白難以被洗脫和被質(zhì)譜分析,，并且蛋白的分子量通常不能滿足數(shù)據(jù)庫鑒定的需要,。相反，肽段容易從凝膠上洗脫下來,，并且即使來自蛋白的一小批的肽段也能提供足夠的用于鑒定的信息,。如圖1，展示了一個與源于血小板的生長因子（platelet-derived growth factor ,，PDGF）信號有關(guān)的分子的分析,。通過這個圖可以闡明這些步驟典型地與一個蛋白的質(zhì)譜分析有關(guān)。此外一個詳細的描述質(zhì)譜鑒定信號分子的方法和策略草案在參考14中能找到,。
蛋白的質(zhì)譜鑒定有兩種主要方法,。在最初由Henzel及其合作者提出的"肽段質(zhì)譜圖"（peptide-mass mapping）方法中，需要在質(zhì)譜法中對肽段混合物進行預洗脫，這導致了致力于蛋白質(zhì)"肽段質(zhì)譜指紋"（peptide-mass fingerprint）的研究,。這種質(zhì)譜法是從一個相關(guān)的單一質(zhì)譜法--介質(zhì)輔助的激光解吸/離子化（matrix-assisted laser desorption/ionization ,，MALDI）中得到的，該法導致一段混合肽段的發(fā)散飛行時間（框2和圖1b）,。MALDI鑒定程序的自動化有了發(fā)展,，由此數(shù)以百計的蛋白斑點能被切離、酶法消化,，所得到的質(zhì)譜能自動地在數(shù)據(jù)庫中收索16,，17。隨著數(shù)據(jù)庫中更多完整長度的人類基因的描繪,，MALDI法所鑒定的成功率將更進一步地提高,。
在一個對快速和確定的蛋白鑒別二步法中，MALDI的指紋識別是第一步18,。蛋白識別的第二種方法依靠肽段混合物中的單個肽段的碎裂片斷來得到序列信息,。在這個方法中，肽段直接從液相中被"電噴霧離子化"（electrospray ionization）所電離,。肽段離子被噴進一個"串聯(lián)質(zhì)譜儀"（tandem mass spectrometer）中,。該質(zhì)譜儀能分解混合物中的肽段，每次隔離一類片斷然后分裂成以氨基或羧基結(jié)尾的片斷（圖1c）,。串聯(lián)質(zhì)譜法在技術(shù)較MALDI指紋識別法更為復雜且不可升級,。它主要的優(yōu)點是對于一個蛋白的鑒別，由幾個肽段得到的序列信息要比一列肽段集合得到的序列信息更為特異,。碎裂片斷的數(shù)據(jù)不僅能用于搜索蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫還能用于核苷數(shù)據(jù)庫例如表達序列標記（expressed sequence tag ,，EST）數(shù)據(jù)庫，甚至最近有用于天然的基因組序列數(shù)據(jù)庫 （B. Küster, P. Mortensen, J. S. Andersen 及 M. Mann,，該數(shù)據(jù)尚未出版）,。
質(zhì)譜法的新發(fā)展
生物質(zhì)譜法仍在迅速的發(fā)展，這要歸功于在各個領(lǐng)域內(nèi)持續(xù)的技術(shù)發(fā)展,。例如,，一種MALDI離子源和高效串聯(lián)質(zhì)譜儀聯(lián)用的新型質(zhì)譜儀最近已經(jīng)開發(fā)出來，它能打碎獨特的肽段19,。假如這個MALDI使飛行時間增加3倍的裝置被證明是足夠靈敏的話,，那么它將使高產(chǎn)量的肽段繪圖法和特異性的肽段測序法聯(lián)用起來，從而用一步法代替原來的二步法質(zhì)譜分析策略,。以我們的經(jīng)驗,，這套裝置已經(jīng)有效地增強了小蛋白的分析能力提高了分析簡單蛋白混合物時的產(chǎn)量。在利用微型人造芯片使蛋白質(zhì)小型化的準備中,，成就也是有的,，在此已經(jīng)得到了有前途的結(jié)果20-22,。然而，這些方法仍沒有產(chǎn)生出利用標準試管或微量滴定板形式預備的靈敏度或穩(wěn)定度,。用MALDI質(zhì)譜法直接掃描單向或雙向凝膠仍然需要長時間的精力,。最近一個變化是在電泳轉(zhuǎn)移到一個收集膜時利用一個插入的隔膜，隔膜包括固定不動的用于降解蛋白質(zhì)的胰蛋白酶,。然后這個膜通過MALDI產(chǎn)生出的一個針對每個凝膠定位的肽段圖來光柵化而被分析,。
在未來，值得直接通過質(zhì)譜法來分析一個蛋白樣本,，而不用凝膠分離或酶解,。Smith等把天然的蛋白提取物裝進一個毛細管然后利用蛋白質(zhì)的等電點通過毛細管電泳來分離蛋白27。被分離的蛋白然后直接被注入到一個專門的傅立葉變換離子回旋共振（FTICR）質(zhì)譜儀中（圖2）,，然后數(shù)以百計的精確的蛋白質(zhì)分子量在一個單一跑動即可得到,。在這個實驗中，集中的發(fā)布趨向于小蛋白,，而且僅是大多數(shù)的而不是同一的蛋白能被確定,。但是在未來也許有可能用這種策略通過在線的蛋白碎裂片斷來鑒定蛋白28-29。這將使研究者們在一個單一的自動化實驗內(nèi)可以完成整個蛋白質(zhì)組的分析,，這種方法至少對于中等豐度的可溶性蛋白這個子集來說是可以的,。
翻譯后修飾
蛋白質(zhì)組學研究的一個獨特性是分析蛋白翻譯后修飾的功能,。磷酸化,、糖基化和硫酸化還有許多其它的修飾對蛋白的功能是極為重要的，因為它們能決定蛋白的活性,、穩(wěn)定性,、定位和循環(huán)。這些修飾顯然通常不是來自基因組序列或者mRNA表達的數(shù)據(jù),。然而質(zhì)譜法是精選的蛋白質(zhì)組學方法來確定蛋白質(zhì)的修飾,，這項工作比純粹的蛋白特性的確定要困難的多。最小限度的數(shù)據(jù)--經(jīng)常少至一兩個肽段需要被成片斷化,，已經(jīng)足夠鑒別序列數(shù)據(jù)庫里的蛋白質(zhì),。然而，為了得到翻譯后修飾的種類和位置,，所有沒有達到預期分子量的肽段需要進一步的分析,。由于種種原因，較之蛋白質(zhì)識別來說,，更多的材料需要被用來研究翻譯后修飾,。在該領(lǐng)域中已經(jīng)有了持續(xù)的進展，特別是在磷酸化事件中,。磷酸化事件能用普通的策略研究,，因為磷酸化的肽段要比未被修飾過的重80Da,，從而能引起一個特殊的質(zhì)譜片斷（PO3-，質(zhì)量79）,。磷酸化的肽段能吸附到金屬樹脂上,，能被特異的抗體識別而且磷酸基團能被磷酸酶去除掉30-34。例如：圖1顯示了依據(jù)基于金屬樹脂吸附的微凈化和磷酸酶處理的磷酸化肽段的探測,。
磷酸化作用和信號途徑
個別受體介導的信號途徑導致一大批的酶作用底物發(fā)生酪氨酸磷酸化作用,。為了鑒別這些底物，沒受刺激的和受生長因子刺激的細胞的溶菌液能被雙向凝膠特殊處理而分解,。所關(guān)心的蛋白能被32P標記物所探測到,，或者可以用帶僅能識別活性態(tài)分子的抗體的western-blotting來探測（例如特異的磷酸化的酪氨酸或磷酸化的絲氨酸抗體）。最近證明這些斑點然后能被質(zhì)譜所鑒別35,。然而有一個更好的替代方法：首先利用質(zhì)譜鑒定,，在免疫沉淀步驟用抗磷酸化酪氨酸的抗體來濃縮這些底物。在關(guān)于表皮生長因子（EGF）受體途徑這樣一個研究中,，幾個已知的和新的成分最近被報道了36,。
差異展示蛋白質(zhì)組學
雙向凝膠法
直到現(xiàn)在，蛋白質(zhì)組學與雙向凝膠電泳法幾乎是同義的,。比較雙向凝膠法在生物醫(yī)學中的應用,，其目的通常是識別那些在特異疾病中用于診斷標識物或治療對象的高度規(guī)則或低度規(guī)則的蛋白質(zhì)。在這些實驗中要面臨幾個技術(shù)性的挑戰(zhàn),。首先,，疏水的和大的蛋白通常不通過凝膠的第二走向。其次,，動態(tài)分布的流動使得幾乎最為豐裕的蛋白質(zhì)難以顯現(xiàn)出,。特別是在體內(nèi)流體，象血漿和腦脊液,，超過99％的蛋白完全是由血清蛋白和球蛋白組成的,。再次，由于生物學的突變在這些樣本中遺傳下來了,，所以很難定義與疾病狀態(tài)下相對應的正常的蛋白表達模式,。就這些應用中的幾個而言，基于陣列的mRNA表達其氨基酸組成的方法不僅能更為廣泛（因為他們提供了用于芯片的所有基因上的數(shù)據(jù)）,，而起更快,、更方便。這已被許多研究所揭示（參見該期由Lockhart 和 Winzeler寫的綜述,，827-836頁,，以及參考文獻37-40）。
盡管有這些比較雙向凝膠法模式存在的困難,，一些應用仍然再一些著作中出現(xiàn)了,。例如,，Celis和她的合作者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一個公認的尿標記物--牛皮癬素--能被用來追蹤調(diào)查患有膀胱鱗狀細胞癌的病人41。當用來自正常組織分泌的蛋白和來自癌組織的蛋白進行比較的時候,，這個標記物就能被識別到,。一個類似的研究比較了利用免疫純化的細胞群得到的正常人類腔狀和肌上皮的乳腺細胞的蛋白質(zhì)組。該研究探測了170個蛋白點陣（是雙重差異表達的結(jié)果）,，其中51個是確定的,。然而幾乎所有的這些蛋白是大量的細胞骨架蛋白，如肌動蛋白和角蛋白,。最近一項研究比較了兩種來自不同血統(tǒng)的小鼠中提取到的腦髓片斷的蛋白質(zhì)補體43,，發(fā)現(xiàn)超過1，000個能遺傳的突變蛋白的點陣,。如此研究在其它位置也許有用,，例如在野生型和基因敲除型小鼠的蛋白質(zhì)組的比較中。毒理學研究經(jīng)常用蛋白質(zhì)組的分析來理解藥物作用機制或確定藥物作用的靶部位,。當比較對腎毒性缺乏免疫力或者有抵抗力的腎臟樣本時,，Aicher和同事們發(fā)現(xiàn)鈣黏蛋白（鈣黏素－D，28K）水平下降與環(huán)孢霉素A引導的腎毒性有關(guān)44,。
當雙向凝膠法作為一種分離某種定性的蛋白亞類的方法和作為反對整個細胞比較制備法時,，或者當免疫學的方法用來使某蛋白亞類顯露出時，生物學上的有關(guān)問題就更容易解決了,。如許多分泌蛋白能用雙向凝膠法分析細胞系的上清液和腫瘤組織的移植物而被識別45,。幾個研究團體已經(jīng)用來自患過敏癥病人體內(nèi)的抗體，探測到了來自引起過敏癥的生物體內(nèi)的雙向凝膠蛋白46,，47,。用合理的預防和治療策略的設(shè)計方法可以開發(fā)一個通過質(zhì)譜法識別過敏源的方法,。
我們預測蛋白表達分析在良好定義的區(qū)域內(nèi)將最為有用,，如（1）不含mRNA的樣本的分析，如某些體內(nèi)流體的分析,；（2）蛋白發(fā)豐度和mRNA的豐度不相關(guān)的情況下,；（3）涉及蛋白翻譯后修飾（如糖基化或磷酸化）的關(guān)鍵變化而非蛋白豐度的變化的情況下；（4）全面描述最為豐裕的特殊來源的蛋白,，其本身是重要的情況下,；（5）雙向凝膠允許相關(guān)地全面描述一個簡單蛋白質(zhì)組樣本（如對于微生物的描述）的情況下。
蛋白質(zhì)芯片
在蛋白質(zhì)芯片方法中,，許多"誘餌"蛋白如抗體,，能以陣列的格式被固定在特殊處理的物體表面上（圖4）。然后其表面用感興趣的樣本探測,，而且只有那些能與相關(guān)抗體吸附的蛋白能繼續(xù)吸附在芯片上48,。這種方法本質(zhì)上是已用于臨床診斷的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）的一個大型版,。在某個版本中，用來自兩種不同期細胞的熒光標記的蛋白探測蛋白質(zhì)芯片,。細胞裂解液用不同熒光標記然后混合,，其顯色效果顯示了附著在抗體上的蛋白質(zhì)的豐度發(fā)生變化的信息。這個系統(tǒng)取決于相當特異的且特征性很好的抗體,，而且許多技術(shù)問題仍需克服,。然而，一旦該系統(tǒng)完善,，它將提供便利的蛋白質(zhì)組分析,。在其它蛋白修飾中，隨著粘合物的發(fā)現(xiàn),，肽段,、蛋白質(zhì)片斷或蛋白質(zhì)也許也能固定到芯片和樣本（如抗生素庫或病人血清）上來應用于芯片技術(shù)。一種用蛋白質(zhì)芯片的方法結(jié)把以上的技術(shù)與一個直接的具有吸附材料的MALDI讀出器結(jié)合起來,。
通過質(zhì)譜法定量
除了以上的方法,，差異展示蛋白質(zhì)組學也能通過質(zhì)譜定量法用有限的或不用蛋白片斷來完成。因為質(zhì)譜圖中的一個肽峰的強度是無法預測的,，所有定量要通過穩(wěn)定同位素標記的兩個狀態(tài)之一來完成,。這種方法已被用于傳統(tǒng)的小分子的質(zhì)譜測定法中，但是最近才被用到蛋白質(zhì)組學上,。細菌的生長,，例如在普通培養(yǎng)基中生長是一種狀態(tài)，在僅含N15而不含N14的培養(yǎng)基中又是一種狀態(tài),。來自兩種狀態(tài)的的蛋白制備物然后被混合,、分離和用質(zhì)譜分析。任何肽段的兩種翻譯現(xiàn)在能被探測到,。 其中一個在質(zhì)譜中通過氮原子的數(shù)量而顯得較強而且峰高的比值精確地量化了相應蛋白的相對數(shù)量,。作為另外一種可選方法，Aebersold和他的同事們在質(zhì)譜法定量樣本前,，引進一個非放射性同位素標記物標記了細胞裂解后的半胱氨酸51,。這種策略使得那些沒經(jīng)過凝膠電泳的極為天然的蛋白混合物中最為豐裕的肽段能被定量。
蛋白和蛋白間的作用
除了蛋白質(zhì)被表達的時間,、位置以外,，一個關(guān)于蛋白質(zhì)的關(guān)鍵問題是它和其它哪些蛋白質(zhì)相互作用。相互作用的伴侶是可以立即直接引起生物學功能而且有可能因其治療目的而被開發(fā),。細胞的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用圖的產(chǎn)生對理解細胞的生物學內(nèi)容有著巨大的價值,。
蛋白質(zhì)復合物的純化
蛋白質(zhì)組學能對蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)的相互作用的研究做出關(guān)鍵性的貢獻52-55。一個研究蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的誘人的方法是通過基于親和力的方法純化這個完整的多蛋白復合體,。這可以通過多種方法達到,，比如：用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）-融合蛋白,、抗體、肽,、DNA,、RNA或是用一個特異吸附到細胞靶部位的小分子。與新蛋白質(zhì)相互作用的伴侶的普通識別方法之一是用抗原決定簇標記它,。然后這個蛋白質(zhì)和與其相互作用的伴侶一起能在細胞里被過渡表達,。而且這個蛋白質(zhì)能通過一個抗抗原決定簇的抗體發(fā)生免疫沉淀反應。這只需要這個基因的足夠長的互補DNA克隆,，而且不用花時間用來產(chǎn)生一個針對感興趣的基因的沉淀抗體,。因為足夠長的cDNAs也許不久就可用于多數(shù)人類基因56，所以大規(guī)模的相互作用的研究將有可能進行,。制作融合蛋白如GST-融合法,是另一個獲得相互作用伴侶的一般方法（圖5）,。這個多蛋白復合物和"誘餌"聯(lián)合，這個誘餌被固定在一個載體上,。洗掉那些非特異性作用的蛋白后,，這個蛋白質(zhì)復合物被洗提、被凝膠電泳分離,，然后用質(zhì)譜分析,。因此在一個單一的試驗里，整個多蛋白復合物的成分能被鑒定出,。例如,，人的接合體作為結(jié)合復合物?quot;誘餌"，已通過用生物素化作用的RNA純化到57,。它的蛋白質(zhì)成分然后被用雙向凝膠電泳展示出來（圖6a）,。從單一的雙向凝膠中有19個新因子被得到了（大多數(shù)在EST數(shù)據(jù)庫中）。他們中的一些被克隆和進一步分析了,。用新蛋白和復合物內(nèi)的其它成分的免疫熒光檢驗法得到的共同定位,，被用于固定那些是復合物真正的成分（圖6b）。一些從這個研究中鑒別出的新因子被克隆和用GST-融合蛋白法生成了,。用圖5里所示的策略,，這些蛋白質(zhì)中的一個被命名為S14的蛋白，沉淀了一系列接合體蛋白（圖6c）,，這結(jié)合其它實驗及序列的生物信息學分析，顯示這個蛋白的一項功能?，F(xiàn)在用以上略述的策略已經(jīng)定性了許多蛋白復合物,。其中一些復合物含有酵母Arp2/3復合物58，該復合物是在酵母的核－孔復合體中發(fā)現(xiàn)的和能結(jié)合分子伴侶GroEL的蛋白復合物60,。
這些研究洞穿了作用機制并且啟動了一系列新的調(diào)查研究,。因為沒有關(guān)于復合物的假設(shè),，細胞作用之間不可置疑的因果關(guān)系例行公事地出現(xiàn)了。例如：一個在小鼠大腦的抑制蛋白-Ⅰ和抑制蛋白-Ⅱ結(jié)合蛋白的研究導致了兩套蛋白的發(fā)現(xiàn),，一個是由控制調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架的信號分子組成,，另一個與細胞的內(nèi)吞作用密切相關(guān)。這個顯示了信號轉(zhuǎn)換途徑和包括抑制蛋白的微絲組裝間存在聯(lián)結(jié)61,。
一旦多蛋白聯(lián)合體的成分被質(zhì)譜分析所確定,，他們的功能就會被有關(guān)的化驗研究。在這個發(fā)展階段,，蛋白質(zhì)組學作為一個重復方式被用來定義與復合物中新蛋白質(zhì)直接相互作用的伴侶,，并且/或者在細胞里和其它的復合物相連接62。
以上提到的策略的成功依賴于蛋白復合物與誘餌充分的親和力,，以及為了純化步驟而需要的最優(yōu)化的條件,。例如：雙標記策略的應用提高了復合物的回收和減少了非特異性蛋白的結(jié)合63。低親和力的相互作用的蛋白在親和純化前能潛在的被化學交聯(lián)的蛋白質(zhì)復合物所捕獲,，因為它依賴于空間的接近而不是親和力,。交聯(lián)也能通過確定最接近的蛋白來幫助闡明蛋白質(zhì)復合物的拓撲結(jié)構(gòu)64。
特殊的細胞器官的成分也開始被分析了,。酵母的高爾基體已被編目,，而且為了確定參與光和作用復合物處理，靶向,，插入和組裝的蛋白質(zhì),，豌豆的葉綠體的成分也被類似地研究了65，66,。通過分析從完整的樣品溶液中消化獲得的天然的肽混合物,，染色質(zhì)間的顆粒已經(jīng)被檢驗分析了67。
酵母雙雜交系統(tǒng)
酵母雙雜交系統(tǒng)是作為一個研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的強大的工具出現(xiàn)的68,。他是一個基于轉(zhuǎn)錄因子模塊結(jié)構(gòu)的遺傳學方法,，這個因子在DNA結(jié)合區(qū)與引起一套基因的轉(zhuǎn)錄增強的活化區(qū)緊密結(jié)合的部位。當?shù)鞍踪|(zhì)是被酵母細胞核里相互作用的兩個ORFs所編碼時,，酵母雙雜交系統(tǒng)是用融合到GAL4 的DNA的結(jié)合區(qū)（DNA binding domain,，DNA-BD）或轉(zhuǎn)錄激活區(qū)（DNA activation domain，DNA-AD）的ORFs來增強一個通訊基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)果,。它的一個主要結(jié)果是一旦一個陽性的相互作用被發(fā)現(xiàn),，僅僅通過測序相關(guān)的克隆就能確定ORF。因為這些原因,，它是一種普通的方法,，它簡單而且很適于作為高通量的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的篩選法。
在大的規(guī)模上，這個策略以兩種形式使用,。在陣列法里,，包含了作為DNA融合物或激活區(qū)的ORFs的酵母菌株，被排列在一個格子上,；然后要被檢驗的ORFs（作為互補的融合物）在整個格子里被篩選以確定能相互作用的菌株（圖4）,。在庫篩選法里，一套ORFs首先總體合并產(chǎn)生一個庫,，然后互補的ORF融合物和這個庫一個接一個地或幾個同時發(fā)生配對（圖7c）,。
在基因組層面上的這種分析已經(jīng)在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 中被報道過了，而且在canorhabditis elegans中到了更限制的程度,。在酵母中,，陣列法被應用在192個ORF，庫篩選法完成了對87％的酵母基因組的測定,。結(jié)合起來,，這個實驗產(chǎn)生了957個假定的相互作用70。另一組分析了酵母中10％詳盡的庫篩選的結(jié)果,，產(chǎn)生了183個假定的相互作用71,。在這兩個大規(guī)模的研究中發(fā)現(xiàn)的相互作用的大多數(shù)是新的。這些相互作用中的一些憑借早先的遺傳學或是生化學的研究看似乎是合理的,，然而大多數(shù)其它的關(guān)聯(lián)不能很容易地確定,。因此，這個研究僅僅提供了可能的相互作用,，這些可能的相互作用必須被進一步的生物學實驗確定或是排除,。這些方法主要的優(yōu)點是他們可以高產(chǎn)量而且是自動化的樣式完成。一個最近所描述的酵母雙雜交方法的改良,，術(shù)語叫"逆轉(zhuǎn)"雙雜交,，可用來鑒定能使蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用中斷的復合物和肽段72。這個可以指導在體內(nèi)具有活性的藥物的開發(fā),，與這相反傳統(tǒng)的藥物篩選是在體外進行的,。
噬菌體展示技術(shù)
噬菌體展示技術(shù)是一種用噬菌體表達肽或是表達融合到衣殼/外殼蛋白上的所感興趣的蛋白質(zhì)的技術(shù)。它可以被用來篩選肽的抗原決定簇,，肽的配合基,，酶作用底物或是單鏈抗體片斷。盡管組合肽庫逐漸被應用在大多數(shù)的以噬菌體展示為基礎(chǔ)的研究中,，但是假如這個cDNA庫的產(chǎn)物被展示在噬菌體顆粒上,，那么更多信息豐富的大規(guī)模的蛋白質(zhì)相互作用的研究就可以進行了。任何一個"誘餌"蛋白可以被固定而捕獲顯示相互作用蛋白的噬菌體顆粒,。這個方法在簡單性和高產(chǎn)量方面,，與酵母雙雜交系統(tǒng)有些相似,。依賴所研究的特殊類型的蛋白質(zhì)（例如細胞質(zhì)對細胞表面蛋白）,，這個方法可能優(yōu)于或是不如雙雜交系統(tǒng),，因為其相互作用發(fā)生在溶液中而非酵母細胞核里。此外,，這個方法原則上適用于不能用酵母雙雜交系統(tǒng)處理的轉(zhuǎn)錄因子,。為了在噬菌體上展示cDNA庫來分離在EGF-受體信號途徑上的信號分子，同時也為了確定和特定抗體反應的抗原,，方法最近被完善了73,，74。
結(jié)論
為了直接在蛋白質(zhì)水平上進行大規(guī)?；蚬δ艿难芯?，蛋白質(zhì)組學提供了一套強大的工具。尤其是,，凝膠分離后的蛋白質(zhì)的質(zhì)譜研究正在導致一場用生化方法研究蛋白質(zhì)功能的復興,。蛋白質(zhì)的特性描述將繼續(xù)在產(chǎn)量、敏感性,、和完整性上提高改善,。翻譯后修飾當前不能在高產(chǎn)量下研究，但是某些種類如磷酸化開始能用一般方法處理了,。我們預測蛋白質(zhì)組學將不再是用雙向凝膠電泳監(jiān)測蛋白質(zhì)表達,。基于質(zhì)譜分析的方法的重要性將繼續(xù)增強,，該方法采用以單向凝膠電泳指導的親和層析,。在不久的以后，蛋白質(zhì)組學將提供出大量的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù),，這可能是它在生物科學上最重要和最直接的影響,。因為蛋白質(zhì)比基因更接近功能，這些研究常常直接導致生物學的發(fā)現(xiàn)或假說,。作為全部克隆的許多人類基因的現(xiàn)成可用性,，其本身是基因組計劃的極為重要的擴展，這將使幾個蛋白質(zhì)組策略變?yōu)榭赡?。用純化蛋白質(zhì)的方法作為確定蛋白質(zhì)功能的化驗將對成千的蛋白質(zhì)自動地以小型化格子的形式平行地執(zhí)行,。最后，基因組學的進展將直接促進大規(guī)模的用遺傳學作為表達方法的蛋白質(zhì)化驗,，就像雙雜交篩選一樣,。
