Michael J Dutt and Kelvin H Lee
School of Chemical Engineering, Cornell University, Ithaca, NY 14853-5201, USA
Correspondence: Kelvin H Lee; e-mail: [email protected]
Current Opinion in Biotechnology 2000, 11:176?79
摘要

蛋白質(zhì)組研究領(lǐng)域隨著基因組序列逐漸完成和不斷注解正變得越來越重要,。近來基因組學(xué)的進(jìn)展包括：表明需要用蛋白質(zhì)分析補(bǔ)充微陣列分析(microarray) 的實(shí)驗(yàn)和數(shù)學(xué)的證據(jù)、分離蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析的敏感性增強(qiáng),、出現(xiàn)更好的凝膠分析和蛋白質(zhì)點(diǎn)注解的信息學(xué)工具,、邁出了實(shí)驗(yàn)步驟自動(dòng)化的第一步和出現(xiàn)新的檢測(cè)蛋白質(zhì)改變的定量技術(shù)。

縮寫
2DE two-dimensional protein electrophoresis雙向蛋白質(zhì)電泳
ESI electrospray ionization電噴霧離子化
IPG immobilized pH gradient固定pH梯度
MALDI matrix-assisted laser desorption ionization基質(zhì)輔助的激光解吸電離
MS mass spectrometry質(zhì)譜
PTM post-translational modification翻譯后修飾
SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel Electrophoresis十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 引言

生物系統(tǒng)的核酸為基礎(chǔ)的分析(比如：DNA序列信息或mRNA表達(dá)微陣列) 開始能夠提供個(gè)體基因以及多個(gè)基因之間協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)本質(zhì)的數(shù)據(jù)資料,。然而,，實(shí)驗(yàn)證據(jù)明確地表明mRNA和它們相應(yīng)的蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平存在差異[1,2]。另外,，通過數(shù)學(xué)方法證明需要mRNA和蛋白質(zhì)兩者的表達(dá)信息來理解一個(gè)基因網(wǎng)絡(luò) [3],。理解總蛋白質(zhì)表達(dá)的需求和需要都推動(dòng)了"蛋白質(zhì)組學(xué)"領(lǐng)域。蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的分析的重要性是研究轉(zhuǎn)錄后調(diào)控以及翻譯后蛋白質(zhì)的修飾(PTMs),。但蛋白質(zhì)組分析近來不是完全絕對(duì)依賴通過二維蛋白質(zhì)電泳(2DE)分離進(jìn)行微化學(xué)的肽定性的,，能夠監(jiān)測(cè)合成速率、表達(dá)水平和蛋白質(zhì)的PTM,。蛋白質(zhì)組分析的領(lǐng)域也主要為技術(shù)的發(fā)展所驅(qū)動(dòng),。和基因組信息或從微陣列分析獲得的數(shù)據(jù)一樣，蛋白質(zhì)組資料需要一個(gè)信息學(xué)的框架結(jié)構(gòu)來組織,。另外一個(gè)信息學(xué)挑戰(zhàn)是建立關(guān)于基因和基因網(wǎng)絡(luò)的蛋白質(zhì)水平和核酸水平信息的有效關(guān)聯(lián),。

由于此綜述的版面限制，我們將只集中討論蛋白質(zhì)組領(lǐng)域的技術(shù)發(fā)展,。我們尤其將討論建立在蛋白質(zhì)電泳分離和隨后的微化學(xué)鑒定溶解的多肽基礎(chǔ)上的蛋白質(zhì)組學(xué),，并討論近來的技術(shù)進(jìn)展,。在過去的12-24個(gè)月里，蛋白質(zhì)組學(xué)的分枝領(lǐng)域享受到近來的技術(shù)發(fā)展,，其中的一些將在此文中重點(diǎn)討論,，并將其放在早期的工作環(huán)境下。我們也引用一些生物技術(shù)團(tuán)體應(yīng)用此技術(shù)的關(guān)鍵性的范例.

技術(shù)

盡管"蛋白質(zhì)組學(xué)"這個(gè)在1996年最早形成[4],，監(jiān)控基因組-廣泛蛋白質(zhì)表達(dá)的主要實(shí)驗(yàn)工具-2DE自1975年就已經(jīng)有了[5],。2DE首先使用等電聚焦通過電荷分離蛋白質(zhì)，然后通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)通過分子大小分離,。Fig1中顯示了2DE成像的一個(gè)例子,。
建立在2DE基礎(chǔ)上的分析蛋白質(zhì)混合物的一個(gè)關(guān)鍵性例子是同時(shí)在分析水平和微制備水平上進(jìn)行分析，而沒有實(shí)驗(yàn)方案,、步驟或設(shè)備的顯著改變,。在初始實(shí)驗(yàn)中，微克級(jí)的蛋白質(zhì)可以被研究鑒定表達(dá)或PTM以有趣的方式改變的蛋白質(zhì),。在此水平上,，可以從單一混合物中分辨到11,200個(gè)蛋白質(zhì)(J Klose, 個(gè)人通訊)。隨后,，同一樣本可以在毫克級(jí)純化以進(jìn)一步進(jìn)行分析,，如氨基酸分析、質(zhì)譜,、氨基末端或內(nèi)部氨基酸測(cè)序和其它技術(shù)[6],。固定pH梯度(IPG)膠條的出現(xiàn)在此領(lǐng)域特別重要[7]。IPG膠條通過將pH梯度共價(jià)遷移到聚丙烯酰胺支持的基質(zhì)上(幾乎消除了pH偏移),，增強(qiáng)了等電聚焦的可重復(fù)性,，并增強(qiáng)了毫克量蛋白質(zhì)混合物的分辨能力。另外一個(gè)IPG膠條的益處是能夠?qū)H分離范圍調(diào)到任何所需范圍內(nèi)的能力,。

其它2DE的重要技術(shù)進(jìn)展包括敏感的蛋白質(zhì)染色方法的發(fā)展,，諸如氨基銀染色[8]，其在鈉克或低于鈉克量能夠檢測(cè)到蛋白質(zhì),，以及凝膠內(nèi)樣品上樣到IPG梯度凝膠條的使用[9[,。凝膠內(nèi)樣品上樣，與在凝膠陽(yáng)極或陰極端上樣相比,，允許應(yīng)用更大體積和量的蛋白質(zhì),，并減少觀察到的與蛋白質(zhì)沉淀相關(guān)的聚焦問題。

分析性2DE應(yīng)用局限,，因?yàn)樗玫慕Y(jié)果(通過電荷和分子大小分離蛋白質(zhì)的表達(dá)模式)在蛋白質(zhì)的實(shí)際身份和起源基因或基因之間不能建立聯(lián)系,。確實(shí)，不能夠完全定性興趣蛋白的改變可能是為什么原先的技術(shù)不能夠普及的原因,。向此技術(shù)的一些簡(jiǎn)單的延伸,，如Western blotting和凝集素親和層析[10,11],，只提供蛋白質(zhì)信息的緩慢的增長(zhǎng)，這些技術(shù)通常用來確定所懷疑的蛋白質(zhì)身份,。 Aebersold等[12]的工作是創(chuàng)新性的,，他們證實(shí)氨基末端和蛋白質(zhì)內(nèi)部的序列信息可以從印跡到膜上的2DE分離的蛋白質(zhì)獲得。直接氨基酸測(cè)序提供了蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)信息之間的重要連接,，為未定性的蛋白質(zhì)提供了遺傳基礎(chǔ),；然而，設(shè)備和試劑費(fèi)用以及直接測(cè)序有限的敏感度一直限制了發(fā)展,。最近，多肽(從2DE凝膠或印跡獲得的消化后的蛋白質(zhì))通過質(zhì)譜(MS)來定性[13],。兩個(gè)蛋白質(zhì)的常見離子化技術(shù)是電噴射電離(ESI)(或更小顆粒的納米噴射)和基質(zhì)輔助的激光解吸電離(MALDI),。這些技術(shù)與不同的質(zhì)譜分析儀配合，它們都有各自的優(yōu)缺點(diǎn),?？偟膩碚f，MALDI-飛行時(shí)間MS對(duì)于分析高分子量的蛋白質(zhì)更為有效,，而ESI離子捕獲MS提供更好的檢測(cè)敏感性,，可以達(dá)到飛摩爾(10-15摩爾)水平。跟詳細(xì)的ESI和MALDI技術(shù)的綜述參見一篇技術(shù)方面的綜述[14],。凝膠分離蛋白質(zhì)和多肽的MS分析的一個(gè)關(guān)鍵特點(diǎn)是能夠產(chǎn)生關(guān)于一個(gè)特殊的興趣肽的結(jié)構(gòu)信息,。比如，質(zhì)譜儀能夠直接提供一個(gè)肽的質(zhì)量的信息,，并又能夠被用來從用源后衰變或碰撞誘導(dǎo)的解離獲得的串聯(lián)質(zhì)譜生成從頭氨基酸序列信息[15,16],。另外，質(zhì)譜儀可以通過檢測(cè)肽段的質(zhì)量偏移提供糖基化模式,、磷酸化或其它PTM的資料,。這種靈活性以及研究其它非蛋白質(zhì)小分子的能力促成了目前對(duì)質(zhì)譜的興趣。下面我們將討論具體應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的MS技術(shù)的進(jìn)展,。

近來串聯(lián)MS已經(jīng)被用來識(shí)別大分子復(fù)合物中的蛋白質(zhì)[17],。該步驟利用雙向?qū)游龇蛛x、肽裂解和隨后的氨基酸序列和基因組序列的比較,。這是一個(gè)快速蛋白質(zhì)鑒定的方法,，它依賴于整個(gè)基因組序列準(zhǔn)確性和預(yù)計(jì)的能力。另外,，另外一種串聯(lián)質(zhì)譜力圖取代對(duì)SDS-PAGE的需求[18],。此方法提供了亞皮摩爾的敏感度(0.3-3pmol)，質(zhì)量測(cè)量的準(zhǔn)確性達(dá)到+/-0.05%而且減少了樣本處理的損失,；但是在蛋白質(zhì)定量上能力有限,。

信息學(xué)

蛋白質(zhì)組學(xué)分析在許多水平上需要信息學(xué)工具,。首先，需要發(fā)展蛋白質(zhì)表達(dá)分布圖的在線數(shù)據(jù)庫(kù),。這樣的數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)該與核酸序列和表達(dá)序列標(biāo)簽的數(shù)據(jù)庫(kù)無縫鏈接和整合,。一個(gè)優(yōu)秀的可進(jìn)入的因特網(wǎng)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)資源是Expert Protein Anlysis System(ExPASy)，現(xiàn)在可以在http://www.expasy.ch/[19]在線獲得,。另外,，需要發(fā)展能夠接受多個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)分布圖并自動(dòng)識(shí)別興趣蛋白量變的軟件包。一些模式識(shí)別軟件可以從許多商家商業(yè)購(gòu)買,，其中的一個(gè)例子是Melanie 3(瑞士生物信息學(xué)研究所,，Swiss Institute for Bioinformatics)[20]。Melanie 3的主要特點(diǎn)包括能夠?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,，與在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),，并與MS譜交互界面作用。
目前急切需要發(fā)展其它軟件工具,，能夠?qū)牟煌瑢?shí)驗(yàn)獲得的未識(shí)別的肽的生物化學(xué)數(shù)據(jù)(比如等電點(diǎn),、分子量和串聯(lián)質(zhì)譜)和蛋白質(zhì)序列、核酸序列和表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)的搜尋結(jié)合起來,，進(jìn)行最可能的遺傳基礎(chǔ)識(shí)別,。

一套蛋白質(zhì)組學(xué)工具現(xiàn)在可以在ExPASy網(wǎng)點(diǎn)獲得[19]。瑞士生物信息研究所持有該數(shù)據(jù)庫(kù),，近來公布了蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)的一個(gè)優(yōu)秀的概要[23],。

應(yīng)用

差異蛋白質(zhì)組分析比較一個(gè)細(xì)胞、組織或生物體的任意一個(gè)參考狀態(tài)的2DE分離的蛋白質(zhì)分布圖和一個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài),，如疾病狀態(tài)或者在系統(tǒng)中加入毒素后,，的分布圖。兩個(gè)蛋白質(zhì)組之間的差異表明系統(tǒng)在擾亂后的反應(yīng)機(jī)制,。差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析應(yīng)用到有興趣的問題上的種類不斷增多,。比如腎臟暴露于鉛后，皮質(zhì)中76種和髓質(zhì)中13種蛋白質(zhì)的量發(fā)生了改變[24],。這項(xiàng)工作突出了蛋白質(zhì)組學(xué)在鑒定毒理學(xué)研究的標(biāo)記物中的應(yīng)用,。細(xì)胞膜表面受體在血小板衍生的生長(zhǎng)因子刺激下的磷酸化狀態(tài)[25]和溫度對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞生成能力[26]的影響是應(yīng)用蛋白質(zhì)組分析突出在對(duì)環(huán)境刺激作用下對(duì)蛋白質(zhì)PTM作用的兩個(gè)例子。低溫CHO細(xì)胞實(shí)驗(yàn)是特別值得注意的,，因?yàn)樗峁┝瞬溉轭惣?xì)胞對(duì)冷刺激反應(yīng),，包括PTM改變，尤其是兩個(gè)蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基的磷酸化,。差異蛋白質(zhì)組分析也能夠幫助識(shí)別轉(zhuǎn)錄后/翻譯前水平的調(diào)控,。通過測(cè)量翻譯控制的腫瘤蛋白質(zhì)和其mRNA豐度的水平，已經(jīng)表明在Cos-7細(xì)胞中鈣的水平在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后步驟調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)[27],。建立在一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)子和其蛋白質(zhì)基礎(chǔ)上的蛋白質(zhì)組分析已經(jīng)提供鼠傷寒沙門氏菌發(fā)病機(jī)制的線索[28],。鼠傷寒沙門氏菌在早期和晚期的指數(shù)生長(zhǎng)期的差異研究已經(jīng)識(shí)別了一系列與生長(zhǎng)調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)[29],。

未來前景

我們?cè)诘鞍踪|(zhì)組學(xué)的目的是蛋白質(zhì)的快速的和定量的特征描述。使用質(zhì)譜和同位素標(biāo)記的新進(jìn)展很有前景,。15N的同位素代謝標(biāo)記能夠幫助從純化的蛋白質(zhì)亞群中識(shí)別和定量蛋白質(zhì),，包括它們的修飾[30]。此技術(shù)對(duì)不同的質(zhì)譜分析儀和離子化技術(shù)都是適用的,。但是此技術(shù)對(duì)于測(cè)量低豐度蛋白質(zhì)有困難,，這是因?yàn)闃悠返纳蠘訉?duì)分析性2DE的限制。近來發(fā)展了另外一個(gè)沒有這種限制的方法[31],。此新方法不局限于與代謝標(biāo)記相容的細(xì)胞,，使得它廣泛應(yīng)用于幾乎任何細(xì)胞或者組織類型。在一個(gè)還原蛋白質(zhì)樣品側(cè)鏈半胱氨酸殘基從一個(gè)化學(xué)試劑的同位素輕（細(xì)胞狀態(tài)1）或重（細(xì)胞狀態(tài)2）型衍生出來,。細(xì)胞聚集,、酶解、用親和層析分離并最后用串聯(lián)質(zhì)譜分離,。LCQTM離子捕獲質(zhì)譜（Finnigan MAT, San Jose, CA）以雙模式操作同時(shí)允許不同細(xì)胞狀態(tài)下肽的定量和序列識(shí)別，這是由于它們使用了不同的標(biāo)簽,。此方法與在DNA芯片上結(jié)合分析兩個(gè)不同狀態(tài)細(xì)胞的mRNA樣品類似,。這個(gè)新的蛋白質(zhì)方法提供了定量比較細(xì)胞和組織的蛋白質(zhì)的一個(gè)廣泛適用的方法。仍然,，在研究低豐度的蛋白質(zhì)有一個(gè)重大的局限性,，因?yàn)槿鄙僖粋€(gè)類似核酸的聚合酶鏈反應(yīng)的擴(kuò)增策略。

一個(gè)特別激動(dòng)人心的進(jìn)展是Denis Hochsstrasser和同事研制的分子掃描儀（Molecular Scanner）[32],。此新技術(shù)利用2DE凝膠,，并結(jié)合蛋白酶消化和電印跡到膜上為單一步驟，隨后生成電印跡"凝膠"的單個(gè)區(qū)域的MS指紋圖（用MALDI-MS）,。此方法理論上可以在一個(gè)凝膠上完全定性所有蛋白質(zhì),。蛋白質(zhì)組學(xué)中自動(dòng)化的深入討論，讀者可以參見澳大利亞蛋白質(zhì)組學(xué)分析機(jī)構(gòu)和瑞士聯(lián)邦技術(shù)研究所的文章[34],。

結(jié)論

在蛋白質(zhì)水平基因表達(dá)信息在不同條件下的基因型－表現(xiàn)型相互關(guān)系之間提供了至關(guān)重要的資料,。這樣的資料在理解此非線性關(guān)系中很關(guān)鍵，并對(duì)代謝和細(xì)胞工程努力是需要的,。在過去12－24個(gè)月中,，在定性和定量蛋白質(zhì)混合物中已經(jīng)有一些重大進(jìn)展，然而,，還有很多需要做,。從對(duì)mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的分布圖平行分析的需要，以及目前對(duì)核酸分析新技術(shù)的矚目來看,，我們可以預(yù)計(jì)發(fā)展蛋白質(zhì)組分析的新技術(shù)將變得越來越重要,。