Dolores J. Cahill
Max-Planck-Institute of Molecular Genetics, Ihnestrasse 73, D-14195 Berlin, Germany
Proteomics: A Trends Guide 2000,July, 47-51

摘要

高密度DNA和蛋白質(zhì)芯片是小的平面，它允許在一次實(shí)驗(yàn)中同步分析幾千個(gè)分子指標(biāo),。DNA芯片導(dǎo)致了更小的樣本體積、更有效的分析和更高的輸出,。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與核酸相比更加復(fù)雜和多樣,，發(fā)展類(lèi)似的蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)已經(jīng)表明是困難的,。此綜述概括近期用于高密度蛋白質(zhì)芯片制作和應(yīng)用的技術(shù)，重點(diǎn)介紹它在蛋白質(zhì)組學(xué)近期的進(jìn)展和應(yīng)用,。

微陣列的生產(chǎn)是一個(gè)高度自動(dòng)化的過(guò)程,，它使用點(diǎn)樣針（pin）為基礎(chǔ)或液體微分配的操縱自動(dòng)儀器在一個(gè)平面上排列生物樣本。對(duì)于DNA芯片的制作,，PCR技術(shù)已經(jīng)成熟建立并在大規(guī)?；蚪M分析中起中心作用。陣列所用的表面隨著應(yīng)用的不同而變化,，比如,，如果需要分析大量樣品與相同配體之間的相互作用，DNA排列到濾膜(比如硝酸纖維素膜,、尼龍膜,、聚偏二氟乙烯)上或者包被有不同試劑(比如多聚－L-賴(lài)氨酸或者聚丙烯酰胺)的玻片上,。

芯片的制作

相似的技術(shù)已經(jīng)被用來(lái)制作高密度蛋白質(zhì)芯片和微陣列（Fig.1）。此方法牽涉到使用格柵自動(dòng)儀器從微滴度平皿轉(zhuǎn)移DNA或者相應(yīng)表達(dá)的蛋白質(zhì)到尼龍膜（Hybond N+, Amersham, DNA分析用）或者聚偏二氟乙烯膜上（Hybond-PVDF, Amersham, 蛋白質(zhì)分析用）上的高密度格柵中,。點(diǎn)樣自動(dòng)儀器在一個(gè)servo控制的3軸線性驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)上攜帶384個(gè)點(diǎn)樣頭,，定位可以準(zhǔn)確到5μm，產(chǎn)生的密度大約為300點(diǎn)/cm2,。吸頭的直徑取決于點(diǎn)樣的應(yīng)用,，但是可以在150μm到450μm之間變化。重組融合蛋白的原位表達(dá)以及表達(dá)的產(chǎn)物用抗含有His-tag表位的抗體檢測(cè),。非特異性結(jié)合的抗體隨之被洗掉,，濾膜與合適的標(biāo)記的二抗以及底物一起孵育。濾膜暴露于紫外線,，用CCD（charge coupled）攝像機(jī)攝取圖像,。專(zhuān)門(mén)的圖像分析軟件隨之被用來(lái)計(jì)數(shù)陽(yáng)性克隆。分格有克隆或PCR產(chǎn)物的尼龍膜－DNA濾膜可以反復(fù)使用至少20次,，而沒(méi)有顯著的信號(hào)強(qiáng)度丟失,。相比之下，排列到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上的蛋白質(zhì)常規(guī)只能使用一次,。用來(lái)制作高密度蛋白質(zhì)芯片的文庫(kù)（單基因系列,，Unigene set）現(xiàn)在可以得到[資源中心/原始數(shù)據(jù)庫(kù)（PZPD），德國(guó)柏林].從液態(tài)表達(dá)培養(yǎng)物中獲得的蛋白質(zhì)純化后,，用轉(zhuǎn)移印章轉(zhuǎn)到平床點(diǎn)樣自動(dòng)儀器上,，進(jìn)行點(diǎn)樣制作蛋白質(zhì)微陣列。使用這個(gè)直徑小于150μm的轉(zhuǎn)移印章,，4800個(gè)樣品可以放到一個(gè)顯微玻片上并可以使用最少量的試劑進(jìn)行同步篩選,。產(chǎn)生的信號(hào)是鮮明的、定位好并且可以檢測(cè)250amol或者10pg的點(diǎn)樣的測(cè)試蛋白質(zhì)（GAPDH為例）,。一個(gè)cDNA蛋白質(zhì)表達(dá)克隆用轉(zhuǎn)移印章技術(shù)可以進(jìn)行可靠的檢測(cè),，以錯(cuò)誤閱讀框表達(dá)蛋白質(zhì)的假陽(yáng)性克隆比率低（11％）。這個(gè)改進(jìn)的排列蛋白質(zhì)的技術(shù)導(dǎo)致了非常敏感的蛋白質(zhì)表達(dá)和高通量篩選的抗體特異性,。使用此方法,，Unigene set中表達(dá)的基因可以在一個(gè)DNA和蛋白質(zhì)水平同步進(jìn)行研究，并提供重組基因和蛋白質(zhì)資源制作DNA和蛋白質(zhì)芯片的資源,。

由于這樣的文庫(kù)存在重復(fù),，一個(gè)改進(jìn)就是生成非重復(fù)、亦稱(chēng)為單克?。║niclone）,、或單基因－單蛋白質(zhì)系列（Unigene-Uniprotein set）基因－蛋白質(zhì)只在陣列中出現(xiàn)一次，結(jié)果導(dǎo)致可以在一個(gè)顯微玻片上進(jìn)行陣列排列,。它需要更小的體積（比如100μl）進(jìn)行篩選（比如血清）,，而不是目前大PVDF膜所需的10ml,。

目前進(jìn)行的工作是用人胎腦cDNA文庫(kù)（hEx1）亞表達(dá)系的寡聚核苷酸指紋圖，群集具有相似序列的克隆,，從每個(gè)群集中選擇一個(gè)克隆,，重新排列陣列生成非重復(fù)的單基因－單蛋白質(zhì)系列。

 Fig.1.蛋白質(zhì)組學(xué)中微陣列的應(yīng)用

蛋白質(zhì)和DNA微陣列可以平行設(shè)置進(jìn)行同步分析文庫(kù)中的基因和其所表達(dá)的蛋白質(zhì),?？乖?抗體芯片也可以從此基因文庫(kù)中制作用于診斷。來(lái)自蛋白質(zhì)芯片的重組蛋白[或者來(lái)自雙向凝膠電泳（2DE）]可以用來(lái)制作最小蛋白質(zhì)鑒別物（MPIs）,它們可以用來(lái)鑒別2DE凝膠上的同源蛋白質(zhì),。它們通過(guò)使用基質(zhì)輔助的激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）進(jìn)行分析,。蛋白質(zhì)微陣列也被用于篩選分析（比如抗體、DNA,、RNA,、代謝物和藥物），抗體芯片用于蛋白質(zhì)組分布圖,，以及核磁共振(NMR)或X線用于大規(guī)模生成的重組蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析,。縮寫(xiě)：PCR,，聚合酶鏈反應(yīng),；IPTG，異丙基硫代－β－D－半乳糖苷,。

直到目前,，仍然沒(méi)有能夠用象DNA芯片那樣的高密度和自動(dòng)化的方法分析蛋白質(zhì)。此問(wèn)題在應(yīng)用類(lèi)似自動(dòng)化技術(shù)到高通量,、大規(guī)模的蛋白質(zhì)分析制作cDNA表達(dá)文庫(kù),、高密度蛋白質(zhì)芯片和微陣列中變得突出。

蛋白質(zhì)芯片的近期進(jìn)展

新技術(shù)

在此領(lǐng)域有許多其它進(jìn)展,，近來(lái)已有綜述,。這樣的進(jìn)展包括在濾膜上制作低密度蛋白質(zhì)陣列，諸如通用蛋白質(zhì)陣列系統(tǒng)（UPA）,。它建立在96孔微滴定板基礎(chǔ)上,。在此系統(tǒng)中,，蛋白質(zhì)微陣列被印到通過(guò)憎水Teflon罩所形成的含有96孔的光學(xué)平玻璃板上[10],。在每個(gè)孔中，使用連接到精確,、高速,、X-Y-Z自動(dòng)儀器上的36毛細(xì)管為基礎(chǔ)的印刷頭點(diǎn)樣144元素（4×36）的陣列。標(biāo)準(zhǔn)ELISA技術(shù)和掃描CCD檢測(cè)器被用于陣列抗原的成像,。

其它蛋白質(zhì)微陣列的方法被報(bào)道使用硅的光刻印刷或者金單層,，結(jié)合使用微球傳感器的微孔或噴墨到聚苯乙烯膜上,。這樣的模式牽涉到通過(guò)定型單個(gè)蛋白質(zhì)（比如BSA、親和素和單克隆抗體）制作微型免疫分析模式,。

抗體芯片

免疫傳感芯片已經(jīng)被研制,，從而可以同步檢測(cè)臨床分析物。這里,，捕獲抗體和分析物被排列到有十字交叉樣流室的顯微玻片上,。檢測(cè)是通過(guò)熒光標(biāo)記和CCD為基礎(chǔ)的光學(xué)讀數(shù)裝置。這是以低密度模式（6×6模式）完成的,，但是此步驟有高通量潛能,，因?yàn)樯婕暗阶詣?dòng)化成像分析和微流體力學(xué)，它已經(jīng)成為酶活力和其它分析的一個(gè)未來(lái)模式(Caliper Technologies, Mountain View, CA, USA; Orchid Biocomputer, Princeton, NJ, USA),。

一個(gè)制作抗體陣列的進(jìn)一步方法已經(jīng)被描述,，它使用微模水凝膠‘印章‘和一個(gè)氨基接受表面。此印章將蛋白質(zhì)存放為亞單層,，可以用125I標(biāo)記或原子能顯微鏡顯示,，而抗體活性是保持的。

寡聚核苷酸芯片

一個(gè)凝膠光學(xué)或過(guò)硫酸鹽誘導(dǎo)的共聚合技術(shù)已經(jīng)被發(fā)展來(lái)制作聚丙乙烯凝膠墊上的寡聚核苷酸,、DNA和蛋白質(zhì)微芯片三維陣列（從10×1μm到100×100μm）,其為一個(gè)憎水玻璃界面所分隔,。三維聚丙乙烯凝膠提供了比二維玻璃支持物超過(guò)100倍固定的能力，因此顯著地增強(qiáng)了測(cè)量的敏感性,。

組織芯片

組織微陣列已經(jīng)被研制進(jìn)行腫瘤標(biāo)本的高通量分子分布圖,，它使用自動(dòng)穿孔柱（0.6mm寬，3－4mm高）,，采取1000個(gè)包埋在石蠟中的個(gè)體腫瘤活檢組織,，將它們排列到45×20mm石蠟塊中（可以從Beecher Instruments, Silver Spring, MD, USA購(gòu)得）。連續(xù)切片后,，腫瘤標(biāo)本進(jìn)行免疫組化,、熒光原位雜交（FISH）和RNA/RNA原位雜交的平行分析。此系統(tǒng)能夠在不到2小時(shí)內(nèi)顯微掃描含有645個(gè)標(biāo)本的免疫組化陣列玻片,。它對(duì)于許多處于不同疾病階段的不同患者的同步分析,，快速建立新的候選標(biāo)記基因中有應(yīng)用。

芯片

捕獲和分析特異性標(biāo)記的蛋白質(zhì)的配體包被的表面現(xiàn)在已經(jīng)有了,，包括SELDI蛋白質(zhì)芯片（Ciphergen Biosystems, Palo Alto, CA, USA）,XNA on Gold(INTERACTIVA, ulm, Germany)和多種Biacore芯片（Biacore, Uppsala, Sweden）,。表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振，此項(xiàng)Biacore應(yīng)用的新進(jìn)展對(duì)芯片模式的相互作用的研究貢獻(xiàn)很大,。SELDI和BIA-MS技術(shù)將親和捕獲和高分辨率質(zhì)譜分析與新的,、有效定性蛋白質(zhì)和相互作用的配手的手段結(jié)合了起來(lái)，并有諸如表位作圖和受體－配體或蛋白質(zhì)－藥物相互作用研究的應(yīng)用。

優(yōu)點(diǎn)和應(yīng)用

陣列技術(shù)相對(duì)傳統(tǒng)分析儀器的主要優(yōu)點(diǎn)是廣泛的平行分析,。因?yàn)檫@樣的陣列或芯片比傳統(tǒng)測(cè)試系統(tǒng)要小,，它們因此在標(biāo)本和試劑的使用上是高度經(jīng)濟(jì)的。在制作和應(yīng)用DNA芯片上已經(jīng)獲得了重大的進(jìn)展,，比如它們應(yīng)用于差異基因表達(dá)（轉(zhuǎn)錄分布圖）,、單核苷酸多態(tài)性（SNP）基因定型應(yīng)用或者多態(tài)性分析。比如,，Sequenom的MassArray（Sequenom Corp., San Diego, CA, USA）質(zhì)譜為基礎(chǔ)的高通量基因定型涉及到自動(dòng)化的陣列設(shè)計(jì),，它測(cè)定不同基因型之間的質(zhì)量差異。

蛋白質(zhì)芯片同樣促進(jìn)個(gè)體克隆的DNA系列信息與蛋白質(zhì)產(chǎn)物的之間聯(lián)系,，再回到整個(gè)基因組水平,。這使得翻譯的基因產(chǎn)物直接經(jīng)得起高通量實(shí)驗(yàn)的檢驗(yàn)，并建立起蛋白質(zhì)表達(dá)和DNA系列數(shù)據(jù)之間的直接聯(lián)系,。這意味著,，例如，差異表達(dá)的基因通過(guò)cDNA微陣列被識(shí)別后,，同一克隆可以在不同細(xì)胞系統(tǒng)或者通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄和/或翻譯進(jìn)行同步蛋白質(zhì)表達(dá)分析,。在相同的蛋白質(zhì)微陣列上，表達(dá)克隆因?yàn)榕c其它蛋白質(zhì)（比如抗體）和從核酸到小分子配體結(jié)合而被篩選出來(lái),。蛋白質(zhì)陣列的可用性應(yīng)該允許下列功能的進(jìn)行：（1）蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用,；（2）配體－藥物相互作用；（3）酶－底物相互作用,；（4）陣列上進(jìn)行更高通量的分析,。陽(yáng)性的相互作用隨之能夠通過(guò)例如一個(gè)標(biāo)記藥物或配體的存在，通過(guò)將標(biāo)簽相互作用的蛋白質(zhì),，通過(guò)使用一個(gè)特異的抗體或者使用質(zhì)譜測(cè)定相互作用配手的存在而被檢測(cè)出來(lái),。這個(gè)多能性應(yīng)該使得蛋白質(zhì)微陣列成為診斷用途、高通量配體－受體相互作用研究以及抗體特異性定性的多用途工具,。

蛋白質(zhì)芯片的一個(gè)進(jìn)一步應(yīng)用是體液中DNA,、蛋白質(zhì)、肽和抗體的圖譜繪制,，它被認(rèn)為能夠促進(jìn)對(duì)健康和疾病的理解,。比如，通過(guò)篩選血清,、腦脊液和其它健康和疾病的體液可能識(shí)別與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì),。描繪和監(jiān)測(cè)一個(gè)疾病的狀態(tài)，諸如自身免疫性疾病,，通過(guò)監(jiān)測(cè)特殊治療的效應(yīng)或者抗體對(duì)疫苗的反應(yīng),，能夠產(chǎn)生診斷或預(yù)后抗原的信息,。這樣的篩選也能夠產(chǎn)生新的靶標(biāo),，它在生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)有廣泛的用途,。

大數(shù)量的重組蛋白質(zhì)也能夠被用來(lái)生成特異的抗這些高通量蛋白質(zhì)比如噬菌體展示的抗體。這樣的抗體本身也將成為有價(jià)值的資源,，并也能夠被用來(lái)制作抗體芯片,。然而，這種高通量生成的特異性抗體目前是昂貴和需要大量人力的,。能夠獲得大量的重組蛋白質(zhì)也使得這些蛋白質(zhì)大量表達(dá),，也就能夠以高通量形式形成結(jié)晶并進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。這樣的一個(gè)創(chuàng)意目前正在德國(guó)進(jìn)行,，稱(chēng)為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)工廠的一個(gè)多集團(tuán)計(jì)劃,。

蛋白質(zhì)組－基因組鏈接

使用單蛋白質(zhì)系統(tǒng)（Uniprotein Set）中蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)芯片在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用已經(jīng)被認(rèn)為在目前基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法之間架立了橋梁?；蚪M學(xué)方法,，如前所述，是使用DNA芯片繪制一個(gè)細(xì)胞中mRNA庫(kù)的圖譜,，其作為基因表達(dá)的第一層次直接反映了基因活動(dòng)并被用來(lái)研究基因表達(dá)和發(fā)現(xiàn)新的疾病相關(guān)的基因,。這通常是在高密度DNA芯片上進(jìn)行的。蛋白質(zhì)組學(xué)方法涉及使用質(zhì)譜確定的肽譜,、序列標(biāo)簽或者個(gè)體蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)物的片段－離子指紋圖在序列數(shù)據(jù)庫(kù)中識(shí)別個(gè)體蛋白質(zhì),。這兩個(gè)方法可以通過(guò)使用單克隆系列中的蛋白質(zhì)進(jìn)行鏈接。這涉及到具體描述質(zhì)譜提供的最少系列的每個(gè)蛋白質(zhì)信息,，我們命名為"最少蛋白質(zhì)識(shí)別物"（MinimalProtein Identifiers,， MPIs）。MPIs含有準(zhǔn)確的酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量,，連同片段－離子數(shù)據(jù),。它們可以從雙向凝膠電泳（2DE）上切下來(lái)的點(diǎn)和諸如單蛋白質(zhì)系列中的重組蛋白質(zhì)生成并能夠被用來(lái)識(shí)別2DE凝膠上的同源蛋白質(zhì)，反過(guò)來(lái)也是一樣,。通過(guò)使用高通量的基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF）在數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄結(jié)果,。一旦記錄下來(lái)，可以認(rèn)為MPIs將使我們能夠快速識(shí)別已知和未知基因產(chǎn)物,，以及在序列數(shù)據(jù)庫(kù)中識(shí)別蛋白質(zhì),。具備有這些特點(diǎn)后，MPIs使得我們能夠牢靠地比較不同生物樣本的2DE凝膠,，而不必計(jì)較它們的形式,、溶解度和所使用的分離技術(shù)。此方法導(dǎo)致了更加可靠的蛋白質(zhì)識(shí)別,，因?yàn)樗菑?DE凝膠點(diǎn)所測(cè)的MPIs與從表達(dá)蛋白質(zhì)所測(cè)的MPIs進(jìn)行比較,，而不是與從DNA序列預(yù)測(cè)的MPIs進(jìn)行比較。獲得的結(jié)果和識(shí)別的陽(yáng)性結(jié)果可以被測(cè)序或者與從單基因微陣列獲得的表達(dá)圖譜結(jié)果進(jìn)行比較，因此將2DE凝膠獲的結(jié)果與任何被研究中的系統(tǒng)表達(dá)圖譜進(jìn)行了鏈接,。

未來(lái)展望

這樣一個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)方法的缺點(diǎn)是它需要不僅應(yīng)用已建立的技術(shù)諸如高性能的微陣列,、大規(guī)模的表達(dá)和高分辨率的2DE，也需要新發(fā)展的自動(dòng)化技術(shù),。這些包括自動(dòng)化2DE,、凝膠成像、點(diǎn)識(shí)別,、蛋白質(zhì)裂解后的點(diǎn)切除,、樣品純化和質(zhì)譜分析以及閉環(huán)數(shù)據(jù)獲取和處理的軟件。一個(gè)高通量MALDI-TOF－MS技術(shù)近來(lái)已經(jīng)被發(fā)展進(jìn)行有力的,、快速和高精度的蛋白質(zhì)控制,。高通量技術(shù)的發(fā)展對(duì)于這樣的蛋白質(zhì)分析是需要的，因?yàn)榇髷?shù)量的蛋白質(zhì)參與機(jī)體的自穩(wěn)態(tài),，即使是最簡(jiǎn)單的有機(jī)體也是一樣的,。

總之，蛋白質(zhì)芯片的進(jìn)步依賴(lài)于改進(jìn)的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng),，因?yàn)楸M管E.Coli產(chǎn)生大量的異源蛋白質(zhì),，此系統(tǒng)有一些缺點(diǎn)。它們包括在蛋白質(zhì)在包涵體中的聚集和累積,，以及細(xì)菌宿主不能進(jìn)行翻譯后修飾,，磷酸化或糖基化。未來(lái)克服這個(gè)問(wèn)題,，我們近來(lái)研制了一個(gè)在Pichi pastoris和E.coli中雙蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng),，它結(jié)合了兩個(gè)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，諸如可溶性蛋白質(zhì)表達(dá)的改善（A.Lueking等,，未發(fā)表）,，但不需亞克隆。這樣表達(dá)的可溶性蛋白質(zhì)對(duì)于許多應(yīng)用是需要的,，比如應(yīng)用于治療,、體外相互作用研究、生成抗體識(shí)別結(jié)構(gòu)表位以及結(jié)晶和核磁共振（NMR）研究,。具有網(wǎng)上檢測(cè)的高通量自動(dòng)化芯片雜交設(shè)備,，加上整合的圖像和數(shù)據(jù)分析工具的改進(jìn)將加快DNA和蛋白質(zhì)芯片輸出的速度和質(zhì)量。

DNA和蛋白質(zhì)芯片似乎是功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的新的和多功能工具,。人們認(rèn)為蛋白質(zhì)芯片將使高通量篩選廣泛種類(lèi)的分子間相互作用成為可能,。因?yàn)檫@是一個(gè)進(jìn)步非常快的領(lǐng)域,，蛋白質(zhì)芯片對(duì)診斷,、藥物篩選,、發(fā)育分析和蛋白質(zhì)組學(xué)的真正貢獻(xiàn)還有待我們眼見(jiàn)為實(shí)。