近幾十年來,，研究人員一直把癌癥看作是一種遺傳疾病，許多人都把研究重點放在確定突變分子生物學和癌癥之間的關(guān)系上,。自上世紀80年代以來,，在關(guān)注基于序列的可遺傳的變化方面的研究取得了一些進展。同時,，表觀遺傳學領(lǐng)域也日益顯露出勃勃生機,，該領(lǐng)域關(guān)注的是與序列無關(guān)的那些遺傳變化,。
南加州大學Keck醫(yī)學院Norris腫瘤綜合中心PeterLaird副教授認為，表觀遺傳學研究領(lǐng)域是一匹真正的黑馬,。他說：“許多研究人員還沒有真正的從事表觀遺傳學的研究,。”在基因組中除了DNA和RNA序列以外，還有許多調(diào)控基因的信息,，它們雖然本身不改變基因的序列,，但是可以通過基因修飾，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì),、DNA和其它分子的相互作用,，而影響和調(diào)節(jié)遺傳的基因的功能和特性，并且通過細胞分裂和增殖周期影響遺傳,，這些都屬于表觀遺傳學研究的范疇,。
PeterLaird表示，表觀遺傳學幫我們解釋了許多疑問,，例如,，為何肝細胞的功能與腦細胞的不一樣，雖然它們都是由同一個受精卵發(fā)育衍生而來的,。因此,，在控制細胞行為，包括與癌癥有關(guān)的控制細胞行為方面,，表觀遺傳學扮演了重要的角色,。實際上，許多表觀遺傳學領(lǐng)域早期發(fā)表的文章都試圖闡述腫瘤中發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳變異情況,。
但是直到20世紀90年代,，研究人員才開始研究癌癥細胞的甲基化變化。令人驚訝的是,，人們并沒有去研究癌癥和這些變化之間的因果關(guān)系,，是Laird等人首開先河，決定更直接的去研究這種因果關(guān)系,。例如,，在Laird的研究中，他選取了非癌性細胞,，包括DNA甲基化作用,，然后思考這些變化在癌癥中的效應(yīng)。
Laird說：“我開始研究這些甲基化作用,，分析它們僅僅是副產(chǎn)品,，還是真正的原因所在。我在1995年發(fā)表的一篇文章中闡述了我的研究結(jié)果：抑制小鼠的甲基化作用,，就能完全阻止人結(jié)腸直腸癌小鼠模型形成腸息肉,。”
聚焦DNA甲基化
DNA甲基化是表觀遺傳學的重要組成部分,，在維持正常細胞功能、遺傳印記,、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生中起著重要作用,，是目前新的研究熱點之一。隨著對甲基化研究的不斷深入,，各種各樣甲基化檢測方法被開發(fā)出來以滿足不同類型研究的要求,。
通常來說，DNA甲基化發(fā)生在DNA啟動子區(qū)域的胞嘧啶殘基上,，尤其是在CpG島上，絕大多數(shù)正常細胞中的基因是不會形成甲基化胞嘧啶核苷酸的,，目前認為CpG島甲基化導致轉(zhuǎn)錄抑制是惡性腫瘤發(fā)生的重要機制之一,，細胞中的甲基轉(zhuǎn)移酶催化了甲基化的形成。
約翰霍普金斯大學腫瘤學教授StephenBaylin表示,，在每一種人類癌癥疾病中,，都能發(fā)現(xiàn)超甲基化基因，包括液體腫瘤和固體腫瘤,。然而,，研究甲基化和癌癥之間的關(guān)系，不在于癌癥細胞是否有甲基化基因,，而是要考慮與癌癥有關(guān)的基因的數(shù)量以及不同的甲基化變異類型,。
因為知道了這些基因的準確位置，就可以采用一種敏感方式――針對腫瘤檢測的一種極其有效的生物標記策略――去進行檢測,。這種策略對風險評估也很有用,，因為可以在癌癥發(fā)育的前期階段，看到腫瘤上的表觀變化,。Laird認為,，DNA甲基化作為一種早期檢測理論，還有許多優(yōu)點,。通過檢測體液如血液中的腫瘤DNA,，能觀察到異常的DNA甲基化模式。但是檢測甲基化也并非易事,。在上世紀70年代的SouthernBlotting實驗中,，早期檢測方法需要依靠甲基化敏感限制性酶，如HpaII,。
在上世紀80年代期間,，研究的主要方法是PCR和克隆，兩者都不涉及甲基化內(nèi)容,，因此很快就被棄用了,。90年代,，Laird開發(fā)了兩類技術(shù)去檢測腫瘤細胞中的甲基化模式，MethylLight和COBRA,，兩者都是以甲基化胞嘧啶的脫氨作用（將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶殘基）以及通過分析方法鑒定修改的序列為基礎(chǔ),。
結(jié)合重硫酸鹽限制性分析法(COBRA法)是由Laird于90年代晚期開發(fā)的。這種方法對DNA樣品進行重亞硫酸鹽處理及PCR擴增,，處理后原甲基化的胞嘧啶被保留,，而非甲基化的胞嘧啶變?yōu)樾叵汆奏ぁｋS后用限制性內(nèi)切酶對轉(zhuǎn)化后PCR產(chǎn)物切割的特性,，識別原標本DNA的甲基化狀況,。最終對非甲基化敏感的序列進行分析，COBRA方法中使用的限制性酶可以對重硫酸鹽處理后誘導的序列變化進行識別,。1999年,，Laird開發(fā)了第二種方法MethylLight，用重亞硫酸鹽處理待測DNA片段,，然后用特異性實時熒光定量PCR(TaqManPCR)反應(yīng)進行擴增,，識別完全甲基化的序列。Methy—Light是一種高度敏感的分析方法,，能夠在未甲基化等位基因超出1萬倍的情況下檢測到甲基化的等位基因,；非常精確地檢測特定DNA甲基化模式的相對豐度，只需少量的模板DNA,。
Laird表示,，需要不斷改進相關(guān)技術(shù)，提高靈敏度,，才能更好的對癌癥細胞中的甲基化模式進行研究,。幸運的是，加州的Illumina公司為此開發(fā)了特定的分析方法,。Illumina公司在早期的分析方法金門分析法（TheGoldenGateAssay）基礎(chǔ)上改良了新的甲基化分析方法,。主要差異在于：GoldenGate分析是三探針設(shè)計，而甲基化分析是四探針設(shè)計,。
Illumina公司的甲基化產(chǎn)品經(jīng)理VivianZhang說：“就工作流程來說,，它們基本上是相同的，只需要對上游的DNA樣本進行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)變,，然后將其加入GoldenGate工作流程平臺即可,。”
