近幾十年來，研究人員一直把癌癥看作是一種遺傳疾病,，許多人都把研究重點(diǎn)放在確定突變分子生物學(xué)和癌癥之間的關(guān)系上,。自上世紀(jì)80年代以來，在關(guān)注基于序列的可遺傳的變化方面的研究取得了一些進(jìn)展,。同時(shí),，表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域也日益顯露出勃勃生機(jī)，該領(lǐng)域關(guān)注的是與序列無關(guān)的那些遺傳變化,。
南加州大學(xué)Keck醫(yī)學(xué)院Norris腫瘤綜合中心PeterLaird副教授認(rèn)為,，表觀遺傳學(xué)研究領(lǐng)域是一匹真正的黑馬。他說：“許多研究人員還沒有真正的從事表觀遺傳學(xué)的研究,。”在基因組中除了DNA和RNA序列以外,，還有許多調(diào)控基因的信息，它們雖然本身不改變基因的序列,，但是可以通過基因修飾,，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、DNA和其它分子的相互作用,，而影響和調(diào)節(jié)遺傳的基因的功能和特性,，并且通過細(xì)胞分裂和增殖周期影響遺傳，這些都屬于表觀遺傳學(xué)研究的范疇,。
PeterLaird表示,，表觀遺傳學(xué)幫我們解釋了許多疑問，例如,，為何肝細(xì)胞的功能與腦細(xì)胞的不一樣,，雖然它們都是由同一個(gè)受精卵發(fā)育衍生而來的。因此,，在控制細(xì)胞行為,，包括與癌癥有關(guān)的控制細(xì)胞行為方面，表觀遺傳學(xué)扮演了重要的角色,。實(shí)際上,，許多表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域早期發(fā)表的文章都試圖闡述腫瘤中發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳變異情況。
但是直到20世紀(jì)90年代，研究人員才開始研究癌癥細(xì)胞的甲基化變化,。令人驚訝的是,，人們并沒有去研究癌癥和這些變化之間的因果關(guān)系，是Laird等人首開先河,，決定更直接的去研究這種因果關(guān)系,。例如，在Laird的研究中,，他選取了非癌性細(xì)胞,，包括DNA甲基化作用，然后思考這些變化在癌癥中的效應(yīng),。
Laird說：“我開始研究這些甲基化作用,，分析它們僅僅是副產(chǎn)品，還是真正的原因所在,。我在1995年發(fā)表的一篇文章中闡述了我的研究結(jié)果：抑制小鼠的甲基化作用,，就能完全阻止人結(jié)腸直腸癌小鼠模型形成腸息肉。”
聚焦DNA甲基化
DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分,，在維持正常細(xì)胞功能,、遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生中起著重要作用,，是目前新的研究熱點(diǎn)之一,。隨著對甲基化研究的不斷深入，各種各樣甲基化檢測方法被開發(fā)出來以滿足不同類型研究的要求,。
通常來說,，DNA甲基化發(fā)生在DNA啟動(dòng)子區(qū)域的胞嘧啶殘基上，尤其是在CpG島上,，絕大多數(shù)正常細(xì)胞中的基因是不會(huì)形成甲基化胞嘧啶核苷酸的,，目前認(rèn)為CpG島甲基化導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制是惡性腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一，細(xì)胞中的甲基轉(zhuǎn)移酶催化了甲基化的形成,。
約翰霍普金斯大學(xué)腫瘤學(xué)教授StephenBaylin表示,，在每一種人類癌癥疾病中，都能發(fā)現(xiàn)超甲基化基因,，包括液體腫瘤和固體腫瘤,。然而，研究甲基化和癌癥之間的關(guān)系,，不在于癌癥細(xì)胞是否有甲基化基因,，而是要考慮與癌癥有關(guān)的基因的數(shù)量以及不同的甲基化變異類型。
因?yàn)橹懒诉@些基因的準(zhǔn)確位置,，就可以采用一種敏感方式――針對腫瘤檢測的一種極其有效的生物標(biāo)記策略――去進(jìn)行檢測。這種策略對風(fēng)險(xiǎn)評估也很有用，因?yàn)榭梢栽诎┌Y發(fā)育的前期階段,，看到腫瘤上的表觀變化,。Laird認(rèn)為，DNA甲基化作為一種早期檢測理論,，還有許多優(yōu)點(diǎn),。通過檢測體液如血液中的腫瘤DNA，能觀察到異常的DNA甲基化模式,。但是檢測甲基化也并非易事,。在上世紀(jì)70年代的SouthernBlotting實(shí)驗(yàn)中，早期檢測方法需要依靠甲基化敏感限制性酶,，如HpaII,。
在上世紀(jì)80年代期間，研究的主要方法是PCR和克隆,，兩者都不涉及甲基化內(nèi)容,，因此很快就被棄用了。90年代,，Laird開發(fā)了兩類技術(shù)去檢測腫瘤細(xì)胞中的甲基化模式,，MethylLight和COBRA，兩者都是以甲基化胞嘧啶的脫氨作用（將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶殘基）以及通過分析方法鑒定修改的序列為基礎(chǔ),。
結(jié)合重硫酸鹽限制性分析法(COBRA法)是由Laird于90年代晚期開發(fā)的,。這種方法對DNA樣品進(jìn)行重亞硫酸鹽處理及PCR擴(kuò)增，處理后原甲基化的胞嘧啶被保留,，而非甲基化的胞嘧啶變?yōu)樾叵汆奏?。隨后用限制性內(nèi)切酶對轉(zhuǎn)化后PCR產(chǎn)物切割的特性，識別原標(biāo)本DNA的甲基化狀況,。最終對非甲基化敏感的序列進(jìn)行分析,，COBRA方法中使用的限制性酶可以對重硫酸鹽處理后誘導(dǎo)的序列變化進(jìn)行識別。1999年,，Laird開發(fā)了第二種方法MethylLight,，用重亞硫酸鹽處理待測DNA片段，然后用特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR(TaqManPCR)反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增,，識別完全甲基化的序列,。Methy—Light是一種高度敏感的分析方法，能夠在未甲基化等位基因超出1萬倍的情況下檢測到甲基化的等位基因,；非常精確地檢測特定DNA甲基化模式的相對豐度,，只需少量的模板DNA。
Laird表示,，需要不斷改進(jìn)相關(guān)技術(shù),，提高靈敏度,，才能更好的對癌癥細(xì)胞中的甲基化模式進(jìn)行研究。幸運(yùn)的是,，加州的Illumina公司為此開發(fā)了特定的分析方法,。Illumina公司在早期的分析方法金門分析法（TheGoldenGateAssay）基礎(chǔ)上改良了新的甲基化分析方法。主要差異在于：GoldenGate分析是三探針設(shè)計(jì),，而甲基化分析是四探針設(shè)計(jì),。
Illumina公司的甲基化產(chǎn)品經(jīng)理VivianZhang說：“就工作流程來說，它們基本上是相同的,，只需要對上游的DNA樣本進(jìn)行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)變,，然后將其加入GoldenGate工作流程平臺(tái)即可。”
