馬薩諸塞州總醫(yī)院（MGH）研究人員首次從育齡婦女卵巢中分離出產(chǎn)卵干細胞,，并指出這些細胞似乎能夠產(chǎn)生正常卵細胞或卵母細胞,。在3月份的Nature Medicine上，馬薩諸塞州總醫(yī)院文森生殖生物學中心的一個研究小組報道了繼2004年Nature上里程碑論文的最新后續(xù)研究,，那篇論文首次提出雌性哺乳動物直到成年仍持續(xù)生產(chǎn)卵子細胞,。
當前研究主要是為了證明產(chǎn)卵母細胞干細胞實際上存在于育齡期婦女卵巢中。這個在成年人卵巢中有卵母細胞前體細胞的發(fā)現(xiàn),，再加上這樣一個事實,，即這些細胞享有生產(chǎn)全功能卵子的特有特性，這就打開了一扇發(fā)展前所未有技術(shù)的大門,，此技術(shù)用于解決婦女不孕問題,，甚至是推遲卵巢功能衰竭時間。
2004年的報道挑戰(zhàn)了自上世紀50年代以來所持的基本觀點：雌性哺乳動物天生卵子的供給是有限的,，整個生命過程都有排卵,，并在更年期衰竭。這一文章和2005年發(fā)表在Cell上的后續(xù)文章都表明,，血細胞或骨髓細胞移植可以恢復因化療而導致生育力被摧毀的成年雌性小鼠產(chǎn)生卵母細胞,，但是這一發(fā)現(xiàn)引起人們的爭議；但是,，在隨后幾年中,，MGH-Vincent研究團隊和世界各地其他研究人員的一些研究支持了上述工作與結(jié)論。
這些支持性研究包括MGH-Vincent研究團隊一篇2007年Journal of Clinical Oncology 上的報道,，這篇報道指出,，卵母細胞被化療摧毀后接受骨髓移植的雌性小鼠能成功地懷孕，并分娩后代,，而且是它們自己遺傳學上的后代,，而不是骨髓捐贈者的。根據(jù)中國上海交大2009年發(fā)表在Nature Cell Biology上的一項研究,，研究人員不僅分離并培養(yǎng)了成年小鼠的產(chǎn)卵母細胞干細胞(oocyte-producing stem cells, OSCs),，而且也指出將這些OSCs移植到化療處理的雌性小鼠卵巢后可促進成熟卵母細胞排出,，受精并發(fā)育成健康后代。
那項研究獨自熄了Nature上早期報道的許多批判性爭論,，即產(chǎn)卵母細胞干細胞存在于小鼠體內(nèi)并能形成功能完全的卵子,。另一篇西海岸生物技術(shù)公司發(fā)表在2010年Differentiation上的文章，提供了對Tilly早期結(jié)論的一個更加獨立的確證,，即成年小鼠卵巢中存在產(chǎn)卵母細胞干細胞,。
這些隨后的研究，盡管提供了成年雌性哺乳動物卵巢中有產(chǎn)卵母細胞干細胞的決定性證據(jù),，但也不是沒有局限性,，它使成年卵泡是否可以更新的問題在科學界公開。例如,，2009年Nature Cell Biology上一篇研究用于分離OSCs的操作就是一種相當粗糙的方法,，這往往導導致目標細胞被其他細胞污染。為了闡明這些,，MGH-Vincent研究團隊開發(fā)并證實了一種更精確的細胞分類技術(shù)，這種技術(shù)可在無其他細胞污染的情況下分離OSCs,。
2009年中國的一項基于細胞表面表達的標志蛋白Ddx4或Mvh的研究也分離出了OSCs,，這種標志蛋白以前只在卵母細胞細胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)。這種與前期研究的明顯矛盾引起了對實驗操作可靠性的關注,。利用先進的熒光激活細胞分選技術(shù),，MGH-Vincent證實標記蛋白ddx4確實是位于卵母細胞內(nèi)，它由一種罕見的和獨特的卵巢細胞群體表達,，而組成這一群體的細胞通過許多基因標記和功能測試而被鑒定為OSC,。
為了檢查分離細胞的功能性，研究人員將GFP標記的小鼠OSCs注射入正常成年小鼠卵巢,，這里的細胞是用新實驗操作方法分離得到的,。幾個月后，對受體小鼠卵巢進行的檢查揭示卵泡中含有有標記蛋白和無標記蛋白的卵母細胞,。在誘發(fā)排卵后,，在從動物輸卵管沖洗出的細胞中發(fā)現(xiàn)有GFP標記和無GFP標記的卵母細胞。取自輸卵管的GFP標記的小鼠卵子在體外成功地受精并產(chǎn)生可發(fā)育到孵化胚泡期(hatching blastocyst stage)的胚胎,，這是一個擁有正常發(fā)育潛力的標志,。
在Tilly認為最具突破性的前兩個實驗中，MGH-Vincen研究團隊使用了他們的新細胞分選技術(shù)來分離成人卵巢中潛在的OSCs,。這樣獲得的細胞有成年鼠卵巢分離細胞的所有遺傳學與生長特性,，能自發(fā)形成具卵母細胞特性的細胞。這些在培養(yǎng)皿中形成的卵母細胞有從人卵巢中卵母細胞所觀察到的外觀特點與基因表達模式,，正如平行小鼠實驗中的情況一樣,，這些體外形成細胞中的一些細胞只有其他機體細胞的一半遺傳物質(zhì),。這項觀察結(jié)果暗示，這些卵母細胞進行了減數(shù)分裂,，這是唯一一個形成成熟卵子與精子的細胞分裂過程,。
接下來將GFP標記的人OSCs注入被活檢的人卵巢組織中，然后移植到免疫缺陷小鼠皮下,。7到14天后人組織移植塊的檢查揭示有GFP陰性和GFP陽性卵母細胞的人未成熟卵泡,，其中前者可能在OSC注射與移植前的人組織中，后者可能來源于注射的人OSCs,。
這些實驗提供了關鍵的觀點證據(jù),，即重輸回成年人卵巢組織的人OSCs發(fā)揮了產(chǎn)生新卵母細胞的預期功能，這里的卵母細胞被宿主細胞形成新卵泡所封閉,。這些結(jié)果是我們用GFP表達小鼠OSCs做同樣實驗所觀察到的,，這種方式形成的GFP表達小鼠卵母細胞能繼續(xù)發(fā)育成全功能卵子。
在這篇文章中,，給那些懷疑我們先前研究的提供了三個關鍵證據(jù),。開發(fā)并廣泛證實一個能可靠地純化成年哺乳動物卵巢OSCs的細胞分選操作，再次證實這些非常專門化細胞的存在,。測試由OSCs產(chǎn)生的小鼠卵母細胞的功能,，結(jié)果表明它們可受精產(chǎn)生健康胚胎。研究人員鑒定并特征化相當數(shù)量的成人卵巢分離的產(chǎn)卵母細胞干細胞,。
這些研究發(fā)現(xiàn)有許多潛在的臨床應用,，Tilly團隊當前正在探討的是人類OSC庫的建立（OSC不象卵母細胞，它可以被無損傷凍存和解凍）,、加速人OSCs源性卵母細胞形成的激素與因素的確定,、體外受精的OSCs源性成熟的人卵母細胞的發(fā)育及提高體外受精與不孕治療方法結(jié)果的其他方法。（生物谷bioon.com）
doi:10.1038/nm.2669
PMC:
PMID:
Oocyte formation by mitotically active germ cells purified from ovaries of reproductive-age women
Yvonne A R White, Dori C Woods, Yasushi Takai, Osamu Ishihara,Hiroyuki Seki & + et al
Germline stem cells that produce oocytes in vitro and fertilization-competent eggs in vivo have been identified in and isolated from adult mouse ovaries. Here we describe and validate a fluorescence-activated cell sorting-based protocol that can be used with adult mouse ovaries and human ovarian cortical tissue to purify rare mitotically active cells that have a gene expression profile that is consistent with primitive germ cells. Once established in vitro, these cells can be expanded for months and can spontaneously generate 35- to 50-μm oocytes, as determined by morphology, gene expression and haploid (1n) status. Injection of the human germline cells, engineered to stably express GFP, into human ovarian cortical biopsies leads to formation of follicles containing GFP-positive oocytes 1-2 weeks after xenotransplantation into immunodeficient female mice. Thus, ovaries of reproductive-age women, similar to adult mice, possess rare mitotically active germ cells that can be propagated in vitro as well as generate oocytes in vitro and in vivo.
