2013年3月14日,，北京生命科學(xué)研究所高紹榮實驗室在《Cell Stem Cell》雜志在線發(fā)表題為“Replacement of Oct4 by Tet1 during iPSC Induction Reveals an Important Role of DNA Methylation and Hydroxymethylation in Reprogramming”的文章,。該文章首次報道了Tet1和5hmC在iPS細(xì)胞誘導(dǎo)過程中參與內(nèi)源Oct4基因的去甲基化和激活，并且進(jìn)一步證明Tet1可以取代外源Oct4實現(xiàn)安全高效的體細(xì)胞重編程,。
誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)是通過在分化的體細(xì)胞中過表達(dá)特定轉(zhuǎn)錄因子,，如Oct4(O)，Sox2(S),， Klf4(K),， c-Myc(M)而實現(xiàn)體細(xì)胞重編程。高紹榮實驗室在2009年通過四倍體補(bǔ)償實驗,，獲得了完全由OSKM iPS細(xì)胞發(fā)育來的小鼠,，從而證明了iPS細(xì)胞具有真正多能性。在隨后的幾年里實驗室一直致力于研究體細(xì)胞重編程過程中的表觀遺傳機(jī)制,。DNA甲基化修飾由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化產(chǎn)生,，主要產(chǎn)物為5-甲基胞嘧啶（5mC）。作為一種重要的表觀遺傳修飾,，DNA甲基化廣泛參與基因表達(dá)的調(diào)控,，組蛋白修飾的建立等過程。在體內(nèi)和體外的多種重編程過程中,，DNA甲基化的去除,，對于全能性基因的激活和組蛋白修飾的重建十分重要。然而,，DNA去甲基化的分子機(jī)制一直不清楚,。近年來，研究發(fā)現(xiàn)Tet家族可以催化5mC的氧化生成5hmC (5-羥甲基胞嘧啶),，從而進(jìn)一步通過不同途徑實現(xiàn)主動去甲基化或被動去甲基化,。最新的研究證明Tet3介導(dǎo)的5mC的羥基化對于受精過程的DNA去甲基化和重編程具有重要作用；Tet1和Tet2也被認(rèn)為參與了PGC發(fā)育過程以及細(xì)胞融合介導(dǎo)的重編程過程中特異位點(diǎn)的去甲基化,。對于轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的體細(xì)胞重編程過程中,，Tet是否參與內(nèi)源全能性基因的去甲基化和重新活化并不清楚。
高紹榮實驗室通過研究首次證明了5hmC和Tet1參與了傳統(tǒng)iPS誘導(dǎo)（OSKM）過程中核心多能基因Oct4的去甲基化和表達(dá)激活,。過表達(dá)Tet1可以促進(jìn)Oct4轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域5hmC的產(chǎn)生,，進(jìn)一步促進(jìn)該區(qū)域的去甲基化和活性組蛋白信號的獲得，實現(xiàn)Oct4的提前激活，進(jìn)而促進(jìn)重編程的發(fā)生,。過表達(dá)Tet1更能夠取代傳統(tǒng)iPS誘導(dǎo)中最重要的轉(zhuǎn)錄因子Oct4,，在其他因子輔助下成功實現(xiàn)體細(xì)胞的重編程（TSKM）。他們隨后發(fā)現(xiàn),，通過四倍體囊胚補(bǔ)償可以獲得完全由TSKM iPS細(xì)胞發(fā)育來的小鼠,，這些TSKM iPS小鼠能健康成長并正常繁殖。與OSKM來源的iPS小鼠具有很高的腫瘤發(fā)生率不同,，這些TSKM iPS小鼠不會發(fā)生腫瘤。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),，與傳統(tǒng)的OSKM iPS細(xì)胞（5mC高,，5hmC低）相比，TSKM iPS細(xì)胞的甲基化和羥甲基化水平更接近于胚胎干細(xì)胞（ESC）,。表明TSKM誘導(dǎo)方法可能更有利于產(chǎn)生低致癌潛能的iPS細(xì)胞,。
他們進(jìn)一步利用TSKM iPS小鼠的成纖維細(xì)胞建立了TSKM的二次誘導(dǎo)體系進(jìn)行機(jī)制研究。他們發(fā)現(xiàn)這個體系能夠?qū)崿F(xiàn)更高效率的重編程,。通過各種實驗手段以及高通量分析,，他們發(fā)現(xiàn)5hmC參與了多個重要的多能性基因和多能性有關(guān)的活性調(diào)控區(qū)域的去甲基化，而重編程過程中獨(dú)特的5mC與5hmC的動態(tài)變化模式,，可能參與了基因組上的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,。這表明DNA甲基化和羥甲基化的改變可能直接影響著細(xì)胞全能性的重新獲得。
總之,，這項研究不僅證明了Tet1和5hmC可以促進(jìn)傳統(tǒng)iPS誘導(dǎo)中Oct4去甲基化和重新激活,，更為體細(xì)胞重編程提供了新的選擇，即通過過表達(dá)Tet1,，直接推動DNA修飾的轉(zhuǎn)變來促進(jìn)細(xì)胞全能性的獲得,。細(xì)胞DNA修飾水平分析和小鼠癌癥發(fā)生的研究，表明TSKM誘導(dǎo)可能通過提高DNA羥甲基化降低iPS細(xì)胞的致癌風(fēng)險,。這為提高iPS細(xì)胞應(yīng)用的安全性提供了重要途徑,。
高紹榮實驗室的博士生高亞威和陳嘉瑜為本文共同第一作者，高紹榮博士和蔡濤博士為該論文的共同通訊作者,。中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心的汪海林博士和學(xué)生黃華也有重要貢獻(xiàn),。參與該工作的還有學(xué)生李珂，吳彤,，劉文強(qiáng),，蔣永華，陸志偉,，徐子健,，康嵐，陳珺；以及技術(shù)員黃波,，寇曉晨,，張郁，姚超,，劉曉蕾,。該研究在北京生命科學(xué)研究所完成，研究得到科技部和北京市政府的資助,。（生物谷Bioon.com）
doi:10.1016/j.stem.2013.02.005
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Replacement of Oct4 by Tet1 during iPSC Induction Reveals an Important Role of DNA Methylation and Hydroxymethylation in Reprogramming
Yawei Gao, Jiayu Chen, Ke Li, Tong Wu, Bo Huang, Wenqiang Liu, Xiaochen Kou, Yu Zhang, Hua Huang, Yonghua Jiang, Chao Yao, Xiaolei Liu, Zhiwei Lu, Zijian Xu, Lan Kang, Jun Chen, Hailin Wang, Tao Cai, Shaorong Gao
DNA methylation and demethylation have been proposed to play an important role in somatic cell reprogramming. Here, we demonstrate that the DNA hydroxylase Tet1 facilitates pluripotent stem cell induction by promoting Oct4 demethylation and reactivation. Moreover, Tet1 (T) can replace Oct4 and initiate somatic cell reprogramming in conjunction with Sox2 (S), Klf4 (K), and c-Myc (M). We established an efficient TSKM secondary reprogramming system and used it to characterize the dynamic profiles of 5-methylcytosine (5mC), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), and gene expression during reprogramming. Our analysis revealed that both 5mC and 5hmC modifications increased at an intermediate stage of the process, correlating with a transition in the transcriptional profile. We also found that 5hmC enrichment is involved in the demethylation and reactivation of genes and regulatory regions that are important for pluripotency. Our data indicate that changes in DNA methylation and hydroxymethylation play important roles in genome-wide epigenetic remodeling during reprogramming.
