急性腦缺血動物模型實驗研究進展
劉紅梅 高天明 佟振清
摘要 腦血管疾病是人類發(fā)病率最高的疾病之一,，模擬臨床疾病,，研制較為可靠的腦缺血動物模型因而顯得尤為重要,。本文著重介紹了常用嚙齒動物全腦和局部腦缺血模型的種類,、制作方法及特點,，對系統(tǒng)研究腦血管疾病的發(fā)病機理,、病理、生理學改變,，以及藥物療效,、防治措施等，在實驗動物模型的選擇方面,，具有一定指導意義,。
關鍵詞：腦缺血 模型 嚙齒動物
腦血管疾病是人類發(fā)病率最高的疾病之一，而且常導致病人殘疾,。人類缺血性腦卒中在其病因,、臨床表現(xiàn)、發(fā)生部位有很大變化,，其嚴格的病理組織,、生化及生理學研究常需借助侵入性外科手術，從而直接摘取腦組織,。而且腦缺血最初幾秒至幾分鐘的缺血損傷研究,，只能依靠實驗動物來完成。另外,，缺血是不正常的血液灌流,，因而需要脈管系統(tǒng)的參與,，而體外培養(yǎng)的組織或細胞缺乏這一重要特征。因此,，模擬臨床疾病,，制作較為可靠的腦缺血動物模型，對系統(tǒng)研究其發(fā)病機理,、病理,、生理學改變，以及藥物療效,、防治措施等,，都具有重要指導意義。
1 嚙齒動物腦缺血模型的科研價值
盡管一些體積較大的動物,，如貓,、狗、兔都曾用于腦缺血研究,，但是大多數(shù)實驗室選擇大鼠或沙土鼠作為研究對象,。這是因為：(1) 大鼠品種多，易于飼養(yǎng),，價格低廉,；(2) 純種鼠屬近親交配，基因型相似,，腦血管解剖和生理機能也相似,；(3) 大鼠腦血管解剖和生理機能接近于人類；(4) 腦血管損傷部位恒定,，實驗重復性好,；(5) 動物存活時間長，利于腦缺血相關病理改變過程的研究,；(6) 腦體積大小適宜,，易施低溫固定技術和組織生化分析；(7) 有關系列大鼠的生理,、藥理和生化方面的實驗資料可供分析比較,；(8) 克服了體外實驗無法實施再灌流的缺陷。(9) 沙土鼠缺乏后交通動脈及完整的基底動脈環(huán),，兩側大腦供血相對獨立,，通過閉塞一側或雙側CCA即可復制效果明顯的同側或雙側腦缺血模型。
2 常用全腦缺血模型
2.1 兩血管閉塞法 Smith等[1]通過夾閉雙側頸總動脈(CCA)合并低血壓以減少腦血流量,，造成急性腦缺血,。腦組織缺血程度可以通過測定腦血流量(CBF)反映出來。嚙齒動物(沙土鼠除外)腦血液循環(huán)有較人類豐富的側支循環(huán),僅結扎雙側CCA不足以明顯降低 CBF，必須結合降壓藥三甲噻吩,、酚妥拉明等降低動脈血壓至6.7 kPa,，使CBF降低至正常的5％～15％。采用這種方法復制的模型,，能進行缺血再灌流損傷的研究,，模擬了臨床上休克、心功能不全,、腦血管嚴重狹窄或阻塞合并血液低灌流引起的腦循環(huán)障礙,，造成不同程度的腦組織缺血損傷。因而,，對于探討人類缺血性腦損傷的發(fā)病規(guī)律,，評價抗腦缺血藥物的療效等有價值。缺點是：(1) 模型不能在清醒動物上復制,，無法研究血管狹窄后行為學的變化,；(2) 腦缺血時限長,，有時導致腦缺血后抽搐,、癲癇等并發(fā)癥的發(fā)生。
2.2 四血管閉塞法 Pulsinelli 等[2]在1979年通過阻斷雙側CCA及椎動脈血流成功建立了四血管閉塞法大鼠全腦缺血模型,。手術分兩個階段：麻醉動物,，頸前正中切口，分離CCA,，將無損動脈夾輕放于雙側CCA周,；同時枕部切口暴露第一頸椎翼小孔，電凝雙側椎動脈,，造成永久性閉塞,。24 h后夾閉雙側CCA，造成明顯的腦缺血,。以大腦皮層,、紋狀體、海馬缺血最為明顯,。解除動脈夾可進行腦缺血再灌流研究,。1983年，作者又改進這一模型,，即在氣管,、食管、頸總動脈,、頸外靜脈后,，頸部肌肉前置一手術絲線，夾閉CCA同時，在氣管后扎緊這根絲線,，以減少頸部皮下組織,、肌肉血液對腦部的供應[3]。這種模型的優(yōu)點是：檢驗缺血是否成功的指標明確[2],；可進行再灌流損傷的研究,；海馬損傷明顯，可顯示記憶功能的減退,。缺點是：手術較復雜,，實驗操作的熟練程度直接影響實驗效果。
2.3 沙土鼠腦缺血模型 沙土鼠缺乏后交通動脈及完整的基底動脈環(huán)[4],，因而結扎單側CCA即造成明顯腦缺血,，被廣泛用于中風病理機制研究。手術操作簡單,，創(chuàng)傷小,，可用于篩選腦活性保護成分或缺血性保護劑的研究。缺點是：(1) 沙土鼠體積小,，生理反應有不穩(wěn)定傾向,，操作技術要求高；(2) 中風發(fā)生率較高,，在CCA夾閉過程中,，需保持動物清醒，便于隨時觀察動物生理狀態(tài)變化,。
2.4 其它
2.4.1 顱內(nèi)加壓法 小腦延池內(nèi)注入人工腦脊液,，使顱內(nèi)壓升高超過動脈血壓2.7～9.3 kPa，同時給予神經(jīng)節(jié)阻滯劑三甲噻方,，防止顱內(nèi)高壓反射性引起高血壓,。
2.4.2 頸部加壓法 麻醉動物，頸部套一止血帶,，加壓至80～93 kPa,，減少腦血流量，造成腦缺血,。
2.4.3 斷頭法 斷頭造成全腦不可逆缺血,，取下腦組織冰凍貯存，常用于生化和代謝分析,。
2.4.4 低氧法 結扎單側CCA合并全腦缺氧,，PaO2維持在2.8 kPa。由于腦部不是真正的缺血,，采用這一模型得到的結論不適用于腦缺血,，但可比較缺氧與腦血流量減少引起效應的不同,。
2.4.5 胸內(nèi)血管夾閉法 開胸，夾閉左側CCA,、頭臂干,、左側鎖骨下動脈，造成全腦缺血,。
3 常用局灶性腦缺血模型
大腦中動脈(MCA)是人群腦卒中的多發(fā)部位,，MCA閉塞模型被普遍認為是局灶性腦缺血的標準動物模型，主要有以下幾種：
3.1 開顱法 Tamura 等[5]采用顳下部開顱,，分離近端MCA,，電凝或用手術絲線結扎MCA，造成腦梗塞,，是目前公認的標準MCA閉塞模型,。以大腦皮層、尾狀核缺血最明顯,。近年來,，這一模型又得到進一步改進。降低動脈血壓以減少伴行血管遠近端分支對梗塞區(qū)的血供,，增大了梗塞面積[6],。Kader改進了電凝方法，閉塞MCA所有可見分支,，梗塞效果好,。Chen等[7]采取鼻縫旁入路,，制作了遠端MCA合并同側CCA永久性閉塞,，對側CCA暫時性閉塞模型。開顱法閉塞MCA,，實驗條件較恒定,，缺血效果可靠，是迄今應用最廣泛的經(jīng)典性局灶腦缺血模型,。其缺點是：需要開顱,，創(chuàng)傷性大，閉塞血管后無法進行再灌性損傷研究,。
3.2 光化學法 Watson等[8]首次建立了光化學法誘導腦皮層梗塞的動物模型,。立體定位儀固定大鼠頭部，暴露顱骨,，尾靜脈注射光敏材料熒光素,，用560 nm波長的特定光源照射局部頭顱，光線透過顱骨與血管內(nèi)的染料接觸,，激發(fā)光化學反應,，引起照射部位皮層血管內(nèi)皮細胞毒性腦水腫而導致腦梗塞[9],。此法適于研究抗血小板、抗血栓形成藥物和血管內(nèi)皮細胞保護劑的療效,。這種模型無須開顱,，動物存活時間長，適于慢性腦缺血研究,；而且皮層梗塞部位可任意選擇,，為皮層功能定位研究提供了條件。但它與人類常見的腦栓塞存在差異,，而且是終末動脈永久性閉塞,，妨礙擴血管藥的治療觀察。
3.3 栓塞法 頸動脈注射血凝塊栓子復制栓塞性腦卒中模型的方法過去只用在大體積動物,，現(xiàn)已在大鼠上得到應用,。Kudo等[10]采用<100 μm的同源血凝塊栓子懸液，注入CCA,，在頸外動脈（ECA）的頸內(nèi)動脈（ICA）開口處置一可逆性插管,，栓子則由ICA進入MCA，導致同側大腦皮層,、海馬,、深層灰質結構的梗塞。也有人用碳素顆粒,、 花生四烯酸鈉作為栓塞劑制成腦梗塞模型,。適于血栓形成過程的研究和溶栓治療的觀察，尤其是人血凝塊栓塞者更具有應有價值,。缺點是：（1）由于栓子的隨機性,，無法預測梗塞部位及大小,；（2）側支循環(huán)的影響使組織缺血程度不一,，不利于組織定量分析。
3.4 插線法 分離暴露頸部血管,，4-0尼龍線從ECA或CCA分叉處插入,，進入ICA，阻斷MCA起始端及其所有側支血流循環(huán),，導致MCA局灶缺血,。輕輕提拉插線，有阻力時提示絲線頭端已達ECA或CCA切口處,，制成再灌流模型,。可將尼龍線頭端燒成鼓槌狀[11],，也可在尼龍線遠端涂一層硅酮彈性體(長度5 cm,直徑0.25 mm)便于插入ICA并脹緊血管[12],。通過實踐測量發(fā)現(xiàn),，插線深度17 mm時，腔內(nèi)線頭一般剛到或接近MCA分支處,，信照亮[13]提出腔內(nèi)線插入深度應達19～20 mm,，并認為翼腭動脈是否結扎對腦梗塞的影響不顯著，從而簡化手術操作,，減少創(chuàng)傷出血,。這種模型無須開顱，MCA閉塞效果較理想,，是目前能進行再灌流損傷研究的較理想局部腦缺血模型,。缺點是：（1）結扎枕、甲狀腺上,、咽升,、舌、上頜外和翼腭動脈需要一定手術技巧,；（2）屬栓塞性腦卒中,，與人群常見的腦卒中存在差異。
4 小鼠腦缺血模型
近年來,，一些作者又建立了小鼠全腦和局部腦缺血模型,。通過結扎雙側CCA后再解除動脈夾，可復制出小鼠全腦缺血再灌流模型[14],。1987年,，Welsh等[15]建立了插線法小鼠局部腦缺血模型。也可用雙極電凝針永久性閉塞MCA,。小鼠腦缺血模型多用于腦組織生化代謝,、評價藥物療效方面的研究。由于動物體積小,，常需借助手術顯微鏡,，應用不太廣泛,。
5 腦缺血損傷的影響因素
5.1 血糖濃度 高血糖可加重腦損傷[16],，增加梗塞面積1.4倍。原因是葡萄糖無氧代謝乳酸大量堆積而導致組織酸中毒,，而且在不完全腦缺血中這一作用尤其明顯,，因為有更多的葡萄糖被運送到腦部。
5.2 腦溫 腦缺血模型往往存在腦低溫保護現(xiàn)象,，腦溫每降低10℃,，大腦代謝率可降低50％。因此在實驗過程中須注意控制腦溫,。腦溫相對于軀體獨立存在,，肛溫不能真實反映腦溫,，須單獨測量腦溫[17]。
5.3 腦血流量 引起腦不可逆性損傷的腦血流量閾值是25 ml/（100 g.min）[18],。
5.4 血壓 自發(fā)性高血壓大鼠在MCA或雙側CCA夾閉后,，腦血流量下降明顯。缺血改變早,，梗塞體積大[19],。
5.5 鼠種 同樣制作Tamura模型，Wistar-Kyoto大鼠MCA閉塞平均腦梗塞體積最小,，變異最大,；Fischer-344大鼠梗塞灶最大，病變一致性好,；Sprague－Dawley大鼠居于兩者之間[19],。
總之，腦缺血動物模型種類很多,，應根據(jù)實驗目的選擇合適的模型制作方法,，并在實驗中注意調控有關指標，對生理學,、生物化學,、形態(tài)學、動物神經(jīng)行為學的監(jiān)控手段,，也應具有科學性和先進性,，以避免產(chǎn)生錯誤的實驗結果。
*國家自然科學基金(39570263)和廣東省自然科學基金(950537)
作者單位：劉紅梅,女,1971年出生,1998年畢業(yè)于第一軍醫(yī)大學,碩士,醫(yī)師,助教,電話85142100
作者單位：劉紅梅 高天明 (第一軍醫(yī)大學南方醫(yī)院超聲診斷科,，廣州,，510515)
佟振清 (第一軍醫(yī)大學生理學教研室，廣州,，510515)
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