中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷體外模型研究進(jìn)展
第一軍醫(yī)大學(xué)南方醫(yī)院神經(jīng)外科(510515) 王克萬（綜述）
第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所(400042) 楊志煥 王正國（審校）
摘 要 中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷體外模型因其能夠精確控制細(xì)胞外環(huán)境，觀察創(chuàng)傷后某種特定細(xì)胞的病理生理變化,，實時監(jiān)測損傷時細(xì)胞生物力學(xué)參數(shù)的改變,，在近年來倍受重視。本文就目前體外創(chuàng)傷模型的種類及有關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。
關(guān)鍵詞：創(chuàng)傷 繼發(fā)性腦損傷 細(xì)胞培養(yǎng) 損傷模型
中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)創(chuàng)傷體外模型能消除在體時缺血和炎癥等各種復(fù)雜因素的影響,，觀察某種特定細(xì)胞的病理生理變化，實時監(jiān)測損傷時細(xì)胞生物力學(xué)參數(shù)的改變,，提供一些在體研究不能得到的信息,，因此近年來倍受關(guān)注。
1 CNS體外創(chuàng)傷模型的種類,、生物力學(xué)機制和評價
近年來基于CNS創(chuàng)傷性損傷機制,，已經(jīng)開發(fā)了許多模型用于研究離斷、擠壓,、加速,、牽張和剪應(yīng)力的作用。
1.1 離斷損傷體外模型
軸索離斷是彌漫性軸索損傷和脊髓橫斷傷的重要病理表現(xiàn),。為此研究者建立了兩種體外離斷損傷模型,。
Gross等(1983)首先用激光進(jìn)行單細(xì)胞突起離斷，可在距細(xì)胞體特定范圍內(nèi)切斷某一突起或數(shù)個突起,。這種模型可提供精確的參數(shù),，可用作脊髓橫斷損傷的體外研究模型。另外一種離斷損傷模型是培養(yǎng)細(xì)胞機械劃痕損傷,。Tecoma（1989）首次采用這種模型研究神經(jīng)元體外創(chuàng)傷性損傷,。Muhkin等[1]改進(jìn)了這種模型，他們用電動的轉(zhuǎn)子進(jìn)行劃痕損傷,，由轉(zhuǎn)子上的針頭數(shù)量來控制損傷的程度和范圍,，具有致傷條件統(tǒng)一，更簡便快捷的特點,。這種模型操作簡單,，費用較低。也是唯一可用來研究繼發(fā)性腦損傷級聯(lián)反應(yīng)的體外模型,。離斷性損傷的缺點是不能獲得力學(xué)參數(shù),，如應(yīng)變力的大小及應(yīng)變率等。
1.2 壓迫損傷體外模型
壓迫性損傷在脊髓損傷中十分常見,，為了在體外模擬壓迫創(chuàng)傷,，Ballentine(1988)用自由落體損傷體外培養(yǎng)的脊髓片來復(fù)制脊髓的壓迫性損傷。這種模型不能測量撞擊的應(yīng)變力和應(yīng)變率,，得不到組織損傷的生物力學(xué)參數(shù),。
另一種是氣壓和液壓損傷模型，可以精確地測定生物力學(xué)參數(shù),。Shepard(1991)用20ms以下6atm的短暫壓力作用于一個密閉的充滿液體的裝置,，使放入裝置內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞損傷。Wallis(1995)等用1kg的重錘從61cm高落體作用于密封的充滿液體的小室，使小室內(nèi)的細(xì)胞受到傳遞的壓力損傷,。Murphy(1993)使培養(yǎng)細(xì)胞承受15atm,、10分鐘，使細(xì)胞產(chǎn)生損傷,。然而在體損傷承受的壓力遠(yuǎn)比體外實驗的壓力低,，長時間持續(xù)壓力也與臨床脊髓損傷機制相差甚遠(yuǎn)。同時由于損傷裝置的不可壓縮性,，與在體損傷的發(fā)生機制明顯不同,。因此，此類模型未得到廣泛的推廣應(yīng)用,。
1.3 加速損傷模型
閉合性顱腦損傷主要是由于頭顱的加速和減速運動產(chǎn)生的腦內(nèi)負(fù)載在腦實質(zhì)中形成剪應(yīng)變所致,。
Lucas(1991)用撞擊振動產(chǎn)生200g加速度作用于培養(yǎng)細(xì)胞，由切應(yīng)力造成細(xì)胞損害,。這種模型的缺點是細(xì)胞對加速的反應(yīng)變化不能測定,。Laplaca[2]改進(jìn)了此模型。這個裝置由兩塊平行的粘度計板組成,，細(xì)胞生長在其中的一塊板上,，這兩塊板浸入培養(yǎng)基中，使其旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的水動力使細(xì)胞致傷,，力的大小由旋轉(zhuǎn)速度和兩板間距離控制,。致傷時可在顯微鏡下由高速攝影觀察細(xì)胞的變化。通過應(yīng)用粘附的微珠,，能夠計算單個細(xì)胞承受的應(yīng)力,。但這種流體壓力的改變與在體創(chuàng)傷的相關(guān)性目前尚不清楚。
1.4 牽張損傷模型
根據(jù)生物力學(xué)研究得到的顱腦創(chuàng)傷發(fā)生時的力學(xué)參數(shù),，近年開發(fā)了培養(yǎng)細(xì)胞牽張損傷裝置,，這種模型已引起廣泛的關(guān)注。
Ellis[3]等用6孔硅膠膜培養(yǎng)皿,，給予一定的正壓使硅膠膜牽張變形,，導(dǎo)致培養(yǎng)于硅膠膜上的細(xì)胞牽張損傷。Cargill等[4]用自制的薄硅膠膜培養(yǎng)皿用真空負(fù)壓沖動使之變形也可使細(xì)胞損傷,。此模型的優(yōu)點是致傷條件易控制,，重復(fù)性好，可以測量應(yīng)變率,，可用不同的應(yīng)變率損傷細(xì)胞,。這種精確的控制有利于比較細(xì)胞對生理或損傷變形的反應(yīng)，對闡明創(chuàng)傷性腦損傷機制有一定作用,。由Morrison[5]報道的改進(jìn)裝置用激光位移轉(zhuǎn)換器直接測量牽張過程中膜的位移,，用計算機控制的電磁閥控制損傷時間和波形,。國內(nèi)同期研制的多功能小型生物撞擊機亦具備這種優(yōu)勢，其計算機控制的電磁閥可精確控制損傷時間和程度,。
因為在腦組織創(chuàng)傷性損傷過程中,，組織承受的力是應(yīng)變和切變的綜合作用，牽張損傷模型具備了這個特性,，細(xì)胞在受到驅(qū)動壓力牽張變形過程中不僅有牽張的應(yīng)力,，而且還承受切變的應(yīng)力。
2 用于體外創(chuàng)傷研究的細(xì)胞類型
2.1 組織培養(yǎng)
組織培養(yǎng)是CNS的組織片或組織塊體外直接培養(yǎng),，細(xì)胞可維持體內(nèi)結(jié)構(gòu)的空間排列狀態(tài)?？梢匝芯考?xì)胞間相互作用,、基于細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)的電生理特性及細(xì)胞外信號分子的分布。但其制備技術(shù)較為復(fù)雜,。細(xì)胞損傷的實時觀測及細(xì)胞應(yīng)變的測定受腦片厚薄的影響,。
2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
原代培養(yǎng)細(xì)胞：由于星形膠質(zhì)細(xì)胞在體外可以分裂，易于純化,，使其成為目前體外損傷研究最常用的原代培養(yǎng)細(xì)胞之一[3],。由于神經(jīng)元是終末分化細(xì)胞，分離純化十分困難,，故目前的培養(yǎng)神經(jīng)元體外損傷研究多是神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)[6],。原代細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點是可以對某種特定細(xì)胞及細(xì)胞間的相互作用進(jìn)行研究。但體外培養(yǎng)細(xì)胞目前仍只能用胎鼠或新生鼠進(jìn)行,，在分離過程中可能造成細(xì)胞損傷,。
細(xì)胞系：細(xì)胞系對生長條件要求較低，易于培養(yǎng),，可以凍存和無限傳代,。細(xì)胞系持續(xù)分化的特性表明它們的基因表型和蛋白表達(dá)已與正常的細(xì)胞顯著不同，因此對于結(jié)果的解釋應(yīng)持慎重態(tài)度,。
3 損傷程度的評估方法
3.1 形態(tài)學(xué)檢查
細(xì)胞損傷后在相差顯微鏡下可實時觀察細(xì)胞損傷的早期變化,。在體外損傷中，細(xì)胞呈現(xiàn)和在體損傷類似的病理形態(tài)學(xué)改變[3],。用掃描電鏡可以觀察到細(xì)胞突起和胞體的斷裂,。細(xì)胞體外損傷后早期超微結(jié)構(gòu)即發(fā)生明顯改變[3]。
3.2 損傷細(xì)胞的檢測
體外細(xì)胞損傷和死亡檢測最簡便的方法是染料拒染法,，常用臺盼藍(lán)(trypan blue),，此法簡便易行[1,6]。Muhkin[1]用酶標(biāo)儀定量檢測臺盼藍(lán)的量,，使這一方法得以進(jìn)一步改進(jìn),。
另外熒光染料碘化丙啶(PI)常被用于鑒定死亡的細(xì)胞,，但Eliis認(rèn)為PI可以鑒別損傷的細(xì)胞，只要細(xì)胞膜完整性破壞,，都可以著色,，當(dāng)細(xì)胞修復(fù)后則又拒染[3]。
鑒定細(xì)胞損傷通透性增高的最常用的生化方法為培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶(LDH)的測定,。LDH測定方法簡便,，結(jié)果穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)LDH結(jié)果與臺盼藍(lán)結(jié)果非常一致,，具有顯著相關(guān)性[6,7],。
3.3 末受損傷細(xì)胞的檢測
MTT(噻唑藍(lán))可透過活細(xì)胞質(zhì)膜被氧化成藍(lán)紫色結(jié)晶，此產(chǎn)物在一定范圍內(nèi)與細(xì)胞數(shù)成正比,，可用比色法測定活細(xì)胞的數(shù)量,。
微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)是特異性分布于神經(jīng)元的胞漿和突起中的細(xì)胞骨架蛋白，神經(jīng)元損傷時免疫組化染色可見MAP-2減少或消失,，MAP-2可以反應(yīng)神經(jīng)元損傷的程度[8～9],。是目前鑒別神經(jīng)元損傷的特異性方法。
3.4 凋亡細(xì)胞的檢測
體外培養(yǎng)神經(jīng)元損傷也同樣有凋亡現(xiàn)象[10],。凋亡細(xì)胞的檢測方法主要有形態(tài)學(xué)檢查,、DNA片段凝膠電泳、原位TUNEL標(biāo)記,、流式細(xì)胞儀檢測等,。
3.5 細(xì)胞功能變化的檢測
在細(xì)胞損傷早期，細(xì)胞功能改變可由核轉(zhuǎn)錄因子c-fos,，c-jun,，NF-κB等特征性向核內(nèi)轉(zhuǎn)位和表達(dá)的變化觀測。作者利用核轉(zhuǎn)錄因子這一特點,，簡便地證明了創(chuàng)傷性損傷混合培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元后,，培養(yǎng)基內(nèi)可釋放出神經(jīng)毒性物質(zhì)。
4 體外損傷模型在創(chuàng)傷性腦損傷研究中的應(yīng)用
4.1 研究體外創(chuàng)傷后細(xì)胞內(nèi)離子失衡和細(xì)胞電生理特性的改變
Rzigalinski[11]等人的研究表明體外損傷后90分鐘,，星形細(xì)胞內(nèi)鈣的含量就達(dá)對照組的2～3倍,。研究中發(fā)現(xiàn)，低鈣可以保護(hù)神經(jīng)元,，但卻增加星形細(xì)胞的質(zhì)膜損傷,，而且增加鈣離子進(jìn)入細(xì)胞的藥物A23187，可以保護(hù)星形細(xì)胞,。作者認(rèn)為這可能是不同的細(xì)胞對損傷的反應(yīng)不同,。在其隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷性牽張損傷引起的鈣離子升高在損傷后3小時到24小時之間恢復(fù)正常,，但損傷可導(dǎo)致鈣介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生持續(xù)性變化,，并認(rèn)為創(chuàng)傷性腦損傷的病理變化過程,，鈣離子介導(dǎo)的信號通路改變可能起重要作用，而不是單純的鈣離子增高[12],。
培養(yǎng)神經(jīng)元牽張損傷后與NMDA受體相關(guān)的電壓依賴Mg2+的阻斷可以減少NMDA受體活化產(chǎn)生的大離子電流和細(xì)胞內(nèi)Ca2+增高[13],。腦片培養(yǎng)的體外損傷模型可以復(fù)制腦損傷后早期時相點的電生理特性。
4.2 研究體外創(chuàng)傷后生化和細(xì)胞因子的改變
Lamb[14]研究表明,，牽張損傷星形細(xì)胞后卵磷脂合成增加,，和脂代謝有關(guān)的酶諸如磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)等酶也升高,。體外損傷模型還可以附加缺氧,、細(xì)胞因子等復(fù)合因素的作用，可以更深入地了解創(chuàng)傷的機制,。Malhotra[15]等用劃痕或/并化學(xué)損傷9L神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系,，導(dǎo)致細(xì)胞肥大，膠質(zhì)纖維酸性蛋白和J1-31抗原免疫組化反應(yīng)增強,，兩種損傷因素具有協(xié)同作用。表明星形細(xì)胞的活化可能與不同的轉(zhuǎn)錄機制有關(guān),。由于沒有小膠質(zhì)細(xì)胞,、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用，以及分離培養(yǎng)時的損傷因素,，因而比原代星形細(xì)胞培養(yǎng)具有某些優(yōu)點,。
4.3 神經(jīng)保護(hù)藥物及機制的研究
體外創(chuàng)傷模型另一重要應(yīng)用是篩選各種神經(jīng)保護(hù)藥物，尋找新的治療手段,。研究表明,，NMDA受體拮抗劑MK801和電壓依賴鈣通道阻滯劑尼莫地平、尼法地平聯(lián)合應(yīng)用對損傷的神經(jīng)元保護(hù)具有協(xié)同作用[6],。NO合酶的抑制劑甲基-L-精氨酸對創(chuàng)傷所致的急性分離海馬腦片的損傷具有保護(hù)作用[16],。白三烯代謝抑制劑對液體叩擊壓力致傷的體外培養(yǎng)海馬腦片具有保護(hù)作用，可以恢復(fù)海馬的順行和逆行的反應(yīng)[17],。
亞低溫對創(chuàng)傷的保護(hù)機制研究在體外容易進(jìn)行,，因為在體外可以精確控制細(xì)胞外環(huán)境的溫度。
4.4 體外創(chuàng)傷分子生物學(xué)研究
體外創(chuàng)傷模型的分子生物學(xué)研究剛剛起步,，研究報道甚少,。它不僅可以用來研究創(chuàng)傷發(fā)生分子生物學(xué)機制，而且是研究創(chuàng)傷基因治療最好的模型之一,。Lefrancois等[18]用反義技術(shù)抑制星形細(xì)胞GFAP的表達(dá),，研究對神經(jīng)元突起離斷損傷后神經(jīng)元突起再生的影響，結(jié)果顯示在反義GFAP轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細(xì)胞中,，在損傷后72小時進(jìn)入損傷區(qū)突起的數(shù)目和長度明顯高于末轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,。由于沒有在體環(huán)境的復(fù)雜性如炎癥,、壞死等情況的干擾，在體外轉(zhuǎn)染比體內(nèi)更有效,。因此體外創(chuàng)傷模型是篩選新的基因治療措施非常有價值的工具,。
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