RNA干擾技術(shù)及其在神經(jīng)科學(xué)研究中的應(yīng)用
王漢森，張玉稚,，潘虹,，吳希如
（北京大學(xué)第一醫(yī)院兒科,，北京 100034）
[摘 要] RNA干擾(RNAi)是指生物體內(nèi)由雙鏈RNA介導(dǎo)同源序列mRNA的特異性降解, 從而導(dǎo)致基因沉默的現(xiàn)象,。近年來(lái),，隨著對(duì)RNAi研究的不斷深入,，其作用機(jī)制正在逐步被闡明,；同時(shí)作為阻斷基因表達(dá)的新手段,，RNAi技術(shù)也日趨完善和成熟,。以其高效性和特異性, RNAi為反向遺傳學(xué)在神經(jīng)科學(xué)研究中的應(yīng)用提供了有力的工具,。本文僅就RNAi技術(shù)的有關(guān)研究進(jìn)展及其在神經(jīng)科學(xué)研究中的應(yīng)用作一概述,。
[關(guān)鍵詞] RNA干擾；神經(jīng)元,；基因功能,；反向遺傳學(xué)
RNAi technique and its application to neurscience research
WANG Han-sen, ZHANG Yu-zhi, PAN Hong, WU Xi-ru
(Department of Pediatrics, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China)
[Abstract] RNA interference (RNAi) is a way by which double-stranded RNA degrades its homological mRNA and leads to gene silencing in cells. With the further studies of RNAi in the last few years, more about its mechanisms has been elucidated. Moreover, as a technique to inhibit gene expression, RNAi is becoming more and more perfect in the studies of functional genomics. It also provides a powerful tool for reverse genetics in neurscience research. The recent advancement in RNAi technique and its application in neuroscience research were concisely reviewed in this paper.
[Key words] RNA interference; neuron; gene function; reverse genetics
RNA干擾（RNA interference, RNAi）是指在多種生物細(xì)胞內(nèi)，由雙鏈RNA（double-stranded RNA,，dsRNA）介導(dǎo)同源序列mRNA的特異性降解,，從而導(dǎo)致基因沉默（gene silencing）的現(xiàn)象,。因RNAi所致的基因沉默發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平,，所以被稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）[1,2]。RNAi現(xiàn)象廣泛存在于大多數(shù)真核生物中,，這種存在揭示了RNAi很可能是出現(xiàn)于生命進(jìn)化的早期階段,。近年來(lái)，隨著對(duì)RNAi研究的不斷深入,，其作用機(jī)制正在逐步被闡明,；同時(shí)作為阻斷基因表達(dá)的新手段，RNAi技術(shù)也日趨完善和成熟,。RNAi為反向遺傳學(xué)( reverse genetics )在神經(jīng)科學(xué)研究中的應(yīng)用提供了有力的工具,，其作用越來(lái)越為人們所重視。
1 RNAi的研究進(jìn)展
1.1 RNAi 的分子機(jī)制 細(xì)胞中dsRNA的存在是RNAi形成的先決條件,。dsRNA可通過(guò)多種途徑在細(xì)胞核或胞質(zhì)中產(chǎn)生,。如反向DNA重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄；同時(shí)合成正義和反義RNA鏈,；病毒復(fù)制,；以單鏈RNA（single-stranded RNA, ssRNA）為模板在RNA依賴性RNA聚合酶 ( RNA-dependent RNA polymerase, RdRP ) 的催化作用下，合成互補(bǔ)RNA序列,，并與之形成dsRNA,。在線蟲(chóng)（C. elegans）可通過(guò)注射dsRNA、將線蟲(chóng)浸泡在含dsRNA的溶液或喂哺表達(dá)正義和反義RNA的細(xì)菌等方式引入dsRNA[3],。小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)是RNAi過(guò)程中重要的中間分子,。siRNA是一類長(zhǎng)約21~23個(gè)核苷酸（nt ）的特殊dsRNA分子，與所作用的靶mRNA序列具有同源性,，每一條鏈的均有2個(gè)nt 3’突出端(end overhangs)。 RNAi主要是通過(guò)dsRNA被核酸酶切割成21～23nt的siRNA, 再由siRNA介導(dǎo)識(shí)別并靶向切割同源性靶mRNA分子而實(shí)現(xiàn)[2, 4],。
通過(guò)對(duì)RNAi所進(jìn)行的遺傳學(xué)與生物化學(xué)的研究,，現(xiàn)已初步闡明了其作用機(jī)制。RNAi的第一步是,，dsRNA在核酸內(nèi)切酶（一種具有RNaseⅢ樣活性的核酸酶）作用下，被加工裂解為21～23nt的由正義和反義序列組成的siRNA,。在果蠅（Drosophila）中RNaseⅢ型核酸酶稱為Dicer,，具有解旋酶（helicase）活性,、dsRNA結(jié)合區(qū)以及PAZ結(jié)構(gòu)區(qū),。在線蟲(chóng),、哺乳動(dòng)物均存在Dicer同類物[1, 4],。RNAi的第二步是，由Dicer產(chǎn)生的siRNA的反義鏈指導(dǎo)形成一種核酸內(nèi)切酶復(fù)合體,，稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex, RISC）。RISC介導(dǎo)切割靶mRNA分子中與siRNA反義鏈互補(bǔ)區(qū)域的中間位置,，使mRNA降解，從而干擾基因表達(dá),。siRNA還可以作為一種特殊的引物,，在RdRP的作用下,，以靶mRNA為模板合成dsRNA分子,，后者又可被RISC降解為新的siRNA,，新生成的siRNA又進(jìn)入上述循環(huán),，這一過(guò)程被稱為隨機(jī)降解性聚合酶鏈反應(yīng)（random degradative PCR）[5],。新生的dsRNA反復(fù)合成與降解,，不斷形成新的siRNA,，從而使靶mRNA漸進(jìn)性減少,，導(dǎo)致目的基因沉默,，呈現(xiàn)RNAi現(xiàn)象,。RdRP一般只對(duì)所表達(dá)的靶mRNA發(fā)揮作用,，這種在RNAi過(guò)程中對(duì)靶mRNA的特異性擴(kuò)增作用,，有助于增強(qiáng)RNAi的特異性基因監(jiān)視作用,。每個(gè)細(xì)胞僅需少量dsRNA即有可能完全抑制相應(yīng)基因表達(dá)，可見(jiàn)RNAi具有生物催化反應(yīng)的基本動(dòng)力學(xué)特征[ 6, 7 ],。
1.2 RNAi的特征 從RNAi的作用機(jī)制，可以看出RNAi具有以下顯著特征[ 1, 2, 8 ]：⑴RNAi是dsRNA介導(dǎo)的PTGS機(jī)制。在此過(guò)程中,，啟動(dòng)子是活躍的，基因可以進(jìn)行正常轉(zhuǎn)錄,，但不能正常積累mRNA, 從而使基因在轉(zhuǎn)錄后水平失活,。⑵高特異性,。RNAi只降解同源mRNA,，而其他mRNA的表達(dá)則不受影響；siRNA除正義鏈3’端兩個(gè)堿基在序列識(shí)別中不起重要作用外,，其他單個(gè)堿基的改變,，就有可能導(dǎo)致RNAi的失敗,。⑶高效性。siRNA能在低于反義核酸幾個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度下,，顯著抑制基因表達(dá)甚至完全敲除,，從而產(chǎn)生缺失突變體表型，比基因敲除更快更簡(jiǎn)單,，而且對(duì)于那些在胚胎中敲除后致死的基因,，也可利用RNAi技術(shù)進(jìn)行研究。此外,， RNAi具有強(qiáng)大的細(xì)胞穿透力,，可在細(xì)胞間傳遞和維持，在線蟲(chóng)中干擾效應(yīng)甚至可以傳遞到后代中去,。
1.3 RNAi技術(shù)的形成與發(fā)展 RNAi作用能夠高特異和高效率地抑制生物體某一基因的表達(dá),，使其不能發(fā)揮作用，為應(yīng)用反向遺傳學(xué)研究基因功能提供了一種快速和簡(jiǎn)便的方法,。隨著RNAi原理在基因功能研究中的應(yīng)用,，RNAi技術(shù)便應(yīng)運(yùn)而生并得到了迅速發(fā)展。
RNAi作為反向遺傳學(xué)研究的工具運(yùn)用于不同的生物體時(shí),，通常所采取的具體方法也有所不同,，這主要是因?yàn)閐sRNA的導(dǎo)入所要求的技術(shù)條件不同引起的,。早期的RNAi技術(shù)首先在線蟲(chóng)和果蠅等低等的動(dòng)物中得到應(yīng)用。dsRNA可通過(guò)直接注射入性腺,、將蟲(chóng)體浸泡入含dsRNA的溶液以及喂哺攜帶可表達(dá)兩條互補(bǔ)ssRNA或發(fā)卡狀RNA（hairpin RNA, hp RNA）的質(zhì)粒的細(xì)菌等3種方式導(dǎo)入線蟲(chóng),。通過(guò)對(duì)線蟲(chóng)直接注射dsRNA的方法，現(xiàn)已明確了許多基因的功能,。將dsRNA直接注射果蠅胚胎的方法,，已在與發(fā)育有關(guān)的基因功能研究得到了應(yīng)用；應(yīng)用載體表達(dá)反向重復(fù)發(fā)卡狀結(jié)構(gòu)的策略,，可以在成年果蠅中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的基因沉默,。但dsRNA誘導(dǎo)RNAi在哺乳動(dòng)物體細(xì)胞的應(yīng)用卻受到阻礙，原因在于dsRNA可通過(guò)激活dsRNA依賴性蛋白激酶和干擾素途徑,，導(dǎo)致蛋白合成廣泛抑制,，以及誘導(dǎo)2’，5’-多聚腺嘌呤酸合成,，激活非特異性的Rnase（Rnase L）,，從而產(chǎn)生對(duì)脊椎動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)的非特異性效應(yīng)[ 9 ]。
小于30 個(gè)nt的dsRNA即siRNA,，已被證明不會(huì)造成上述非特異性反應(yīng),。許多研究者已將其應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并成功地造成對(duì)基因表達(dá)的序列特異性抑制,。所采用的siRNA長(zhǎng)度一般為21~23 nt,，由化學(xué)合成或T 7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄的正義與反義RNA單鏈退火而獲得，并具有2個(gè)nt 3’突出端,。siRNA具有較高的穩(wěn)定性,，以3 ’端突出TT的siRNA尤為穩(wěn)定，由脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞,。siRNA介導(dǎo)RNAi的效能,，取決于siRNA的有效性、轉(zhuǎn)染效率,、細(xì)胞類型以及目的蛋白更新速度等多種因素[ 2, 10,11 ],。
由于有些類型細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的siRNA半衰期短,，體外合成siRNA對(duì)基因表達(dá)的抑制作用通常是短暫的,，因而使其應(yīng)用受到較大的限制,。采用事先在體外構(gòu)建能夠表達(dá)siRNA的載體, 然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA的策略,，不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類增加，而且對(duì)基因表達(dá)抑制效果也不遜色于體外合成siRNA,，在長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞中,，甚至可以發(fā)揮長(zhǎng)期阻斷基因表達(dá)的作用,。在所構(gòu)建的siRNA表達(dá)載體中，是由RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子來(lái)指導(dǎo)RNA合成的,，這是因?yàn)镽NA聚合酶Ⅲ有明確的起始和終止序列,，而且合成的RNA不會(huì)帶poly A尾。當(dāng)RNA聚合酶Ⅲ遇到連續(xù)4個(gè)或5個(gè)T時(shí),，它指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄就會(huì)停止,，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3’端形成1~4個(gè)U。U6和H1 RNA啟動(dòng)子是兩種RNA聚合酶Ⅲ依賴的啟動(dòng)子,，其特點(diǎn)是啟動(dòng)子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游,，適合于表達(dá)～21ntRNA和～50ntRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)（stem loop）。在siRNA表達(dá)載體中,，構(gòu)成siRNA的正義與反義鏈,，可由各自的啟動(dòng)子分別轉(zhuǎn)錄,然后兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合形成siRNA；也可由載體直接表達(dá)小發(fā)卡狀RNA(small hairpin RNA, shRNA), 載體包含位于RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子和4～5Ｔ轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)之間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列,，轉(zhuǎn)錄后即可折疊成具有1~4 個(gè)U 3 ’ 突出端的莖環(huán)結(jié)構(gòu),，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步加工成siRNA。構(gòu)建載體前通常要通過(guò)合成siRNA的方法,，尋找高效的siRNA,，然后從中挑選符合載體要求的序列，將其引入siRNA表達(dá)載體[ 12,13 ],。
然而不管是體外合成siRNA,，還是基于載體的siRNA表達(dá)系統(tǒng)，其作用在很大程度上受到轉(zhuǎn)染的效率的限制,。事實(shí)上只有某些細(xì)胞系才可被有效轉(zhuǎn)染,，而對(duì)于原代細(xì)胞來(lái)說(shuō)，幾乎是不可能的,。病毒載體仍然是目前常用的在細(xì)胞與整體水平進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的有效工具,。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（retroviral vector）能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和原代細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定有效的基因轉(zhuǎn)移。將人H1啟動(dòng)子克隆并插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,，構(gòu)建了能夠表達(dá)siRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,，該載體可以在被感染細(xì)胞中啟動(dòng)RNAi，有效抑制基因表達(dá),；更為重要的是,，它能夠整合到靶細(xì)胞基因組，長(zhǎng)期穩(wěn)定地抑制基因表達(dá),，甚至形成突變的細(xì)胞系,；而且在原代細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了高效率的基因轉(zhuǎn)移，高滴度的病毒對(duì)人原代成纖維細(xì)胞感染率在99%以上，導(dǎo)致了靶基因的穩(wěn)定失活[ 14 ],。慢病毒載體（lentiviral vector）較逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有更廣的宿主范圍,，慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲分裂后的細(xì)胞。用慢病毒自我失活（self-inactivation, SIN）載體構(gòu)建的由H1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)增強(qiáng)綠色熒光蛋白 ( EGFP ) shRNA表達(dá)的載體,，可以在2種穩(wěn)定表達(dá)EGFP 的細(xì)胞系中有效地使EGFP表達(dá)沉默,，這種效應(yīng)起始于感染后3 d，并至少持續(xù)至感染后25 d[ 15 ],。新近報(bào)道的一種由小鼠U6啟動(dòng)子控制shRNA表達(dá)的慢病毒載體 ( pLL3.7 ),，在其U6啟動(dòng)子下游緊接多克隆位點(diǎn)（MCS），為RNAi莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列的插入提供了方便,；還可同時(shí)表達(dá)報(bào)告基因EGFP,，便于對(duì)受感染細(xì)胞的觀察。載體pLL3.7能夠產(chǎn)生表達(dá)shRNA的高滴度的慢病毒,，在周期性和非周期性細(xì)胞,、干細(xì)胞、受精卵以及分化的后代細(xì)胞中表達(dá)shRNA,，實(shí)現(xiàn)在多種類型的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中特異而穩(wěn)定的基因表達(dá)的功能性沉默,，為在原代的人和動(dòng)物細(xì)胞組織中快速而高效地研究基因功能，以及產(chǎn)生特定基因表達(dá)降低的動(dòng)物提供了可能性[16],。慢病毒作為siRNA的攜帶者,，不但具備特異性地使基因表達(dá)沉默的能力，而且充分發(fā)揮了慢病毒載體自身所具備的優(yōu)勢(shì),，為基因功能的研究提供了更強(qiáng)有力的工具,。
2 RNAi技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)研究中的應(yīng)用
RNAi技術(shù)應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)基因功能研究，首先是在線蟲(chóng)和果蠅等低等的模式生物中進(jìn)行的,。Ataxin-2是人脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)II型(spinocerebellar ataxia type 2,，SCA2)基因的表達(dá)產(chǎn)物，其功能尚未明確,。Ataxin-2可以與一種RNA結(jié)合蛋白Ataxin-2結(jié)合蛋白1(ataxin-2-binding-protein 1,，A2BP1)相互作用。Ataxin-2 和 A2BP1的序列在進(jìn)化中較為保守,，兩者在線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）的同源體分別為ATX-2和 FOX-1,。為采用RNAi對(duì)其在線蟲(chóng)的功能特征進(jìn)行研究，用注射或浸泡方式給線蟲(chóng)導(dǎo)入ATX-2和 FOX-1的dsRNA,，結(jié)果成功地誘導(dǎo)了RNAi,，并證明了Ataxin-2同源體在線蟲(chóng)早期胚胎發(fā)育中是必需的[17]。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中,，基因家族的個(gè)別成員可能存在功能冗余,，僅缺失基因家族某一成員的突變體，通常不會(huì)引起表型的顯著變化。利用聯(lián)合RNAi方法,，給野生型果蠅胚胎注射神經(jīng)受體酪氨酸磷酸酶基因家族4個(gè)成員的dsRNA，使這些基因表達(dá)被抑制,，并以染料標(biāo)記注射dsRNA后的胚胎成神經(jīng)細(xì)胞,，觀察了多基因沉默對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突路徑（axon pathway）所造成的影響[18]。給成年的果蠅腹內(nèi)注射dsRNA,，也可引起RNAi,，并可作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的基因。通過(guò)腹內(nèi)注射各自相應(yīng)的dsRNA,，成功抑制了成年果蠅中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因LacZ和內(nèi)源性基因GM06434的表達(dá),，表明這種RNAi技術(shù)方法可以用于成年果蠅中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因功能的研究，并且不會(huì)像突變研究那樣造成對(duì)發(fā)育的干擾[19],。在果蠅神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular junction, NMJ)突觸正常生長(zhǎng)過(guò)程中,，存在突觸回縮（synapse retraction）現(xiàn)象。以RNAi篩選方法對(duì)這一現(xiàn)象的機(jī)制進(jìn)行研究,，發(fā)現(xiàn)dynactin復(fù)合體一個(gè)亞單元Arp-1/centractin對(duì)調(diào)節(jié)該現(xiàn)象有重要作用,，Arp-1 dsRNA能夠增強(qiáng)突觸回縮。而dynactin復(fù)合體的另一成員P150/Glued的突變也可以產(chǎn)生同樣的效應(yīng),。Glued蛋白富含于突觸前神經(jīng)末梢,，顯性失活（dominant-negative）Glued轉(zhuǎn)基因表達(dá)能夠增強(qiáng)突觸回縮。由此可見(jiàn),，dynactin對(duì)于促進(jìn)突觸的穩(wěn)定性起著重要作用[20],。經(jīng)過(guò)剪切可形成dsRNA的基因組cDNA雜交體( hybrid )，可以有效地使其針對(duì)的成年轉(zhuǎn)基因果蠅的靶基因表達(dá)沉默,。這些靶基因包括：lush,，white 和 dGq(alpha)，其表達(dá)均出現(xiàn)嚴(yán)重降低,，white RNAi表型與基因敲除突變之間不存在差別,。該技術(shù)還可有效抑制表達(dá)于神經(jīng)元中的基因，使之成為一種在活體成年果蠅特定細(xì)胞中敲除基因功能的簡(jiǎn)單策略[21],。給蝸牛體內(nèi)注射合成的針對(duì)神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS) mRNA的dsRNA分子,，可以使之出現(xiàn)攝食行為的變化，并干擾了中樞神經(jīng)系統(tǒng)一氧化氮(NO)的合成,，這說(shuō)明dsRNA可以用于以觀察整體動(dòng)物行為為目的的基因功能研究[22],。
siRNA以其在極低濃度下特征性的高效作用，已經(jīng)成為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制（knock down）特定基因表達(dá)的有力工具,。siRNA已應(yīng)用于哺乳動(dòng)物體細(xì)胞和胚胎細(xì)胞系,，成功抑制一系列基因的表達(dá)。RNAi技術(shù)應(yīng)用于哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)基因功能的研究，首先是在一些神經(jīng)系統(tǒng)來(lái)源的細(xì)胞系進(jìn)行的,。體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA,、發(fā)卡狀siRNA以及由含U6 siRNA表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的兩條siRNA鏈和發(fā)卡狀siRNA，均可以顯著降低小鼠P19細(xì)胞向神經(jīng)元分化過(guò)程中神經(jīng)元特異性β-tubulin蛋白的表達(dá),，其中以U6 siRNA表達(dá)載體形成的發(fā)卡狀siRNA抑制作用最強(qiáng),，表明RNAi技術(shù)可以抑制神經(jīng)元分化模型系統(tǒng)中神經(jīng)元特異性基因的表達(dá)，有可能應(yīng)用于哺乳動(dòng)物神經(jīng)分化與神經(jīng)發(fā)生的研究[23],。通常認(rèn)為,，在哺乳類細(xì)胞中, 長(zhǎng)于30 nt的 dsRNA能夠誘導(dǎo)干擾素的表達(dá)和激活蛋白激酶，導(dǎo)致蛋白表達(dá)的廣泛抑制和mRNA的非特異性降解,，使RNAi的應(yīng)用受到限制,。而Gan等[24]的研究發(fā)現(xiàn),以體外轉(zhuǎn)錄合成的平均大小約500-700 bp的dsRNA，可以特異地介導(dǎo)部分和完全分化后的小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤AGYNB010細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性基因表達(dá)沉默,，針對(duì)綠色熒光蛋白（GFP）開(kāi)放閱讀框（ORF）的dsRNA,，使GFP表達(dá)水平顯著降低，而來(lái)源于內(nèi)源基因多（ADP-核糖）聚合酶( PARP ) ORF的ds RNA則顯著降低了PARP的表達(dá),。這一結(jié)果進(jìn)一步提示,，RNAi可以作為有效的工具應(yīng)用于哺乳動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞基因功能的研究。
盡管在培養(yǎng)的線蟲(chóng)神經(jīng)元,，高濃度的dsRNA可誘導(dǎo)其靶基因表達(dá)降低,，但是在原代培養(yǎng)哺乳動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞，siRNA的作用卻不如其他類型細(xì)胞明顯,。這可能是由于RNA跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)或RNAi途徑的不同造成的,。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，化學(xué)合成的siRNA或表達(dá)siRNA質(zhì)粒DNA, 一般是先與親脂性試劑混合后再轉(zhuǎn)染細(xì)胞,，進(jìn)而抑制基因表達(dá),。但是，對(duì)于分裂后原代神經(jīng)元,，轉(zhuǎn)染效率較低,，并且通常有細(xì)胞毒性，因而這些技術(shù)方法很難使siRNA在神經(jīng)元中奏效,。Krichevsky等[25]發(fā)現(xiàn)用陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑（TransMessenger transfection reagent）,，可以較容易地將合成的21 nt 微管相關(guān)蛋白2 (MAP2) 基因的siRNA導(dǎo)入培養(yǎng)大鼠大腦皮層與海馬神經(jīng)元，抑制了MAP2基因表達(dá),，表明RNAi在原代哺乳動(dòng)物神經(jīng)元是能夠發(fā)揮作用的,。短時(shí)間（2 h）低濃度（0.006~0.6 μg/mL）暴露于siRNA，即可造成內(nèi)源性或外源性基因表達(dá)的抑制,，而在此濃度范圍的反義ssRNA,，則不能抑制基因表達(dá),。更高濃度的siRNA/轉(zhuǎn)染試劑，會(huì)對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)元產(chǎn)生毒性,。為研究轉(zhuǎn)錄因子心肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A（myocyte enhancer factor 2A,，MEF2A）對(duì)小腦顆粒神經(jīng)元存活所起的作用，利用以DNA載體為基礎(chǔ)的RNAi技術(shù),，將由U6啟動(dòng)子控制下轉(zhuǎn)錄MEF2A hpRNA的質(zhì)粒,，在大鼠小腦顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)2 d后，以改進(jìn)的磷酸鈣轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染,，轉(zhuǎn)染3 d后以間接免疫熒光方法觀察，發(fā)現(xiàn)MEF2A hpRNA有效而特異地降低了小腦顆粒細(xì)胞MEF2A蛋白水平,；MEF2A hpRNA還顯著抑制了小腦顆粒細(xì)胞內(nèi)MEF2A依賴的基因轉(zhuǎn)錄活動(dòng)和顆粒神經(jīng)元存活,。該研究進(jìn)一步表明，RNAi技術(shù)可以成功地應(yīng)用于分裂后哺乳動(dòng)物神經(jīng)元,；以其相對(duì)簡(jiǎn)單,，基于載體的RNAi方法為哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中基因功能研究提供了便捷的工具[26]。
以RNAi技術(shù)在成年轉(zhuǎn)基因小鼠抑制外源基因表達(dá)的成功,，促使人們?cè)谡w動(dòng)物水平上運(yùn)用該技術(shù)研究腦組織基因的生理功能,。Makimura等[27]以RNAi技術(shù)研究了agouti相關(guān)肽 （agouti-related peptide，AGRP）對(duì)代謝功能的影響,，將合成的siRNA注射于下丘腦弓形核,，24 h后可以使AGRP mRNA降低50%，用能夠在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄hpRNA的質(zhì)粒pSUPER轉(zhuǎn)染該區(qū)神經(jīng)元,，可以導(dǎo)致AGRP免疫反應(yīng)性的更為持久的降低,。該研究首次表明，RNAi可以被用于降低成年哺乳動(dòng)物內(nèi)源性基因的表達(dá),，評(píng)價(jià)在神經(jīng)元表達(dá)的內(nèi)源性基因所發(fā)揮的生理作用,。進(jìn)一步改進(jìn)其表達(dá)系統(tǒng)，特別是結(jié)合基于病毒載體的基因轉(zhuǎn)移方法,，RNAi將會(huì)更為有效和持久地降低基因表達(dá),，成為研究哺乳動(dòng)物基因尤其是表達(dá)于腦組織基因的生理功能的有力工具。
3 結(jié)語(yǔ)
迄今為止,，反向遺傳學(xué)依然是人們研究基因功能的最有效的手段,。以同源重組為基礎(chǔ)的基因打靶技術(shù)，是反向遺傳學(xué)中普遍采用的方法,，但它有著實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng),、成本昂貴等缺點(diǎn)。反義方法如反義寡核苷酸和核酶技術(shù),，雖然能夠在一定程度上彌補(bǔ)這些不足,，但在實(shí)際應(yīng)用中仍然受到很大的限制,。在過(guò)去幾年里，對(duì)RNAi的研究業(yè)已向人們展示了生物體存在一種嶄新的調(diào)控機(jī)制,。從單細(xì)胞原生動(dòng)物到高等哺乳類,，RNAi都為調(diào)控基因表達(dá)提供了全新的手段，無(wú)疑給實(shí)驗(yàn)生物學(xué)研究帶來(lái)了一場(chǎng)革命[1,2],。
神經(jīng)系統(tǒng)作為體內(nèi)最為精密和復(fù)雜的系統(tǒng),，其基因表達(dá)與調(diào)控也存在著自身的特殊性與復(fù)雜性，使傳統(tǒng)的反向遺傳學(xué)方法在該領(lǐng)域的應(yīng)用面臨巨大的挑戰(zhàn),。RNAi技術(shù)在神經(jīng)系統(tǒng)基因功能研究的初步應(yīng)用,，表明了它在神經(jīng)科學(xué)研究中應(yīng)用不僅是可行的，而且有著廣闊的前景,。隨著RNAi技術(shù)的不斷發(fā)展與完善,，如表達(dá)載體系統(tǒng)的更新、轉(zhuǎn)染方式的改進(jìn),，尤其是結(jié)合以逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒等病毒載體為基礎(chǔ)的基因轉(zhuǎn)移方式,，RNAi技術(shù)必將在神經(jīng)科學(xué)研究中得到最大限度的應(yīng)用，給神經(jīng)系統(tǒng)基因功能研究帶來(lái)新的飛躍,。
[參 考 文 獻(xiàn)]
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[中圖分類號(hào)] R338;R394.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [基金項(xiàng)目] 國(guó)家自然科學(xué)基金（30200152,30271374）
[通訊作者] 潘虹,，吳希如 [聯(lián)系電話]（010）66171122-3236 [作者簡(jiǎn)介] 王漢森（1969 - ）,，男，山東人,，博士后,，主要從事發(fā)育中腦甲基化CpG結(jié)合蛋白2基因功能研究.
