NOV對人神經(jīng)干細胞增殖和分化的影響
李成仁,，李巍,，蔡文琴,，蘇炳銀，陳德英
（第三軍醫(yī)大學基礎(chǔ)部組織學與胚胎學教研室,，重慶 400038）
[摘要] 目的:探討NOV蛋白對人神經(jīng)干細胞(HNSCs)增殖和分化的影響,。方法:NOV基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細胞,，收集COS-7細胞和NOV基因修飾COS-7細胞的條件培養(yǎng)液(COS-CM和NOV-CM),，作用于培養(yǎng)的HNSCs,，3H-TdR摻入液閃檢測HNSCs的增殖，免疫細胞化學和流式細胞儀檢測HNSCs的分化,。結(jié)果:(1) NOV-CM能明顯促進HNSCs對3H-TdR的攝入,，說明NOV-CM能明顯促進HNSCs的增殖，另外NOV-CM的促細胞增殖作用具有一定的量效關(guān)系,；(2)免疫細胞化學和流式細胞儀結(jié)果顯示,，NOV-CM促進HNSCs向神經(jīng)元方向分化。結(jié)論: NOV蛋白可能具有促進HNSCs增殖和分化的作用,。
[關(guān)鍵詞] 腎母細胞瘤過度表達基因,，人神經(jīng)干細胞，增殖,，分化
Effects of NOV protein on proliferation and differentiation of human neural stem cells
LI Cheng-ren, LI Wei, CAI Wen-qin, SU Bing-yin, CHEN De-ying
(Department of Histology and Embryology, Basic Medical College, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
[Abstract] Objective:To explore effects of nephroblastoma overexpression gene(NOV) protein on proliferation and differentiation of human neural stem cells(HNSCs). Methods: After NOV was transfected into COS-7 cells with liposome method, conditioned mediums(CMs) of COS-7 cells and COS-7 cells modified by NOV gene were collected (COS-CM and NOV-CM, respectively). Proliferation of HNSCs cultured in the CMs was detected with incorporation of 3H-TdR, and differentiation of HNSCs was examined using immunocytochemistry and flow cytometry. Results: (1)NOV-CM markedly promoted incorporation of 3H-TdR to cultured HNSCs in a concentration-dependent manner, indicating that NOV-CM promotes proliferation of HNSCs. (2) NOV-CM increased differentiation of HNSCs to neurons, but decreased to astrocytes. Conclusion: NOV protein could promote proliferation and differentiation of HNSCs.
[Key words] nephroblastoma overepression gene; human neural stem cells; proliferation; differentiation
神經(jīng)干細胞(neural stem cells, NSCs)的研究作為神經(jīng)科學研究熱點已近10年,，人們不僅從胚胎和成年哺乳動物腦內(nèi)分離培養(yǎng)了NSCs[1~4]，近年來研究證實在人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)也存在NSCs[5~7],。我們曾成功地分離培養(yǎng)了人胚大腦皮層NSCs[8],。NSCs研究的迅猛發(fā)展，打破了中樞神經(jīng)系統(tǒng)不能再生的傳統(tǒng)觀念,，為許多以前棘手的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如神經(jīng)退行性疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療帶來了曙光,。研究發(fā)現(xiàn)，許多因子如生長因子和營養(yǎng)因子,，對NSCs的增殖和分化都具有重要作用,。我們以前的研究顯示腎母細胞瘤過度表達基因(nephroblastoma overexpression gene，NOV) 是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的一個調(diào)控因子[9, 10],，NOV蛋白對人NSCs的增殖和分化有什么作用呢,？本實驗在分離培養(yǎng)人胚大腦皮層NSCs的基礎(chǔ)上，研究NOV蛋白對其增殖和分化的影響,，為人NSCs的研究和應(yīng)用提供一些基礎(chǔ)資料,。
1 材料與方法
1.1 生物材料及試劑 自10~14周人胚大腦皮層培養(yǎng)的HNSCs,COS-7細胞,含NOV全長基因的pcDNA3.1/Myc-His(+)/lacZ重組質(zhì)粒由本實驗室培養(yǎng)和構(gòu)建，DOTAP 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒和G418購自Roche公司,， 3H-TdR購自上海原子能研究所,，NOV抗體(多抗)由法國Perbal教授惠贈，NF-200抗體(多抗),、GFAP抗體(多抗)和Gal抗體(多抗)均購自Sigma公司,。SABC試劑盒、SABC-FITC和SABC-Cy3購自博士德公司,。
1.2 方法
1.2.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的COS-7細胞和篩選 采用Roche公司的DOTAP脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒包裹重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的COS-7細胞,，按說明書操作,。G418(500μg/ml)篩選14d后收集G418抗性細胞，調(diào)整細胞濃度后繼續(xù)培養(yǎng),。轉(zhuǎn)染了NOV基因的COS-7細胞簡寫成NOV/COS-7細胞,。
1.2.2 Western Blot檢測轉(zhuǎn)染基因的表達 具體方法參照盧圣棟主編的《現(xiàn)代分子生物學技術(shù)》一書[11]。收集COS-7細胞和NOV/COS-7細胞條件培養(yǎng)液(conditioned medium, CM)以及細胞的裂解液,，進行Western Blot檢測,。
1.2.3 COS-7細胞和NOV/COS-7細胞CM的制備與使用 生長狀態(tài)良好的COS-7細胞和NOV/COS-7細胞，傳代于50ml培養(yǎng)瓶中,，細胞數(shù)約為106/瓶,，培養(yǎng)48h待細胞生長穩(wěn)定后以等量無血清培養(yǎng)基換液，繼續(xù)培養(yǎng)24h,，收集CM,，簡稱為COS-CM和NOV-CM。將收集的CM用0.22μm孔徑濾膜過濾,，-20℃保存,。使用時的劑量一般為整個培養(yǎng)液的一半，即將培養(yǎng)NSCs的培養(yǎng)液吸出1/2后再加入相同體積的CM,。部分實驗中設(shè)置了換液1/3或全換為CM的濃度組,，即CM占最終液體量的1/3或全部(稱1/3，1/2及全劑量組),。一般不作特殊說明時,，CM占總培養(yǎng)液的1/2。
1.2.4 液閃檢測HNSCs對3H-TdR攝入的影響 HNSCs按每孔105的細胞密度種植于24孔培養(yǎng)板,，24h后分為對照組,、COS-CM組和NOV-CM組，每組8孔,，對照組不換液,，COS-CM組和NOV-CM組分別用收集的COS-CM和NOV-CM換液一半，繼續(xù)培養(yǎng)48h,，最后24h加入3H-TdR(1μCi/孔),。另種植相應(yīng)數(shù)量的HNSCs，培養(yǎng)24h后將細胞分為對照組和NOV-CM (1/3,，1/2及全劑量組),，每組8孔，分別用對應(yīng)液體量的NOV-CM換液,，繼續(xù)培養(yǎng)48 h,，最后24h加入3H-TdR(1μCi/孔)，觀察不同濃度CM對3H-TdR攝入的影響。用自動多頭細胞收集器收集細胞于玻璃纖維濾紙,，沖洗固定,，80℃烤干，加入閃爍液,，置于γ液體閃爍計數(shù)儀測cpm值,。
1.2.5 HNSCs的分化 HNSCs按每瓶約5萬的細胞密度種植于預先涂有多聚賴氨酸的50 ml培養(yǎng)瓶中(或每皿約1萬的細胞密度種植于預先放有多聚賴氨酸涂布的蓋玻片的35㎜培養(yǎng)皿中)，將細胞分為對照組,、COS-CM組和NOV-CM組,，每組三瓶,。正常對照組僅含5%胎牛血清培養(yǎng)基,，COS-CM組與NOV-CM組分別用收集的COS-CM和NOV-CM換液一半后加入5%胎牛血清，分化7d和14d后終止培養(yǎng),，進行免疫細胞化學或免疫熒光和流式細胞儀檢測,。
1.2.6 免疫細胞化學和免疫熒光染色 培養(yǎng)于蓋玻片上的細胞，以4%多聚甲醛固定30min,。采用抗NF-200(1∶1000 ),、抗GFAP (1∶200 )和抗Gal(1∶200 )抗體分別標記神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞,。在免疫細胞化學染色中設(shè)陰性對照,，用 PBS液代替一抗。具體方法參照蔡文琴主編的《實用免疫細胞化學與核酸分子雜交》一書[12],。
1.2.7 流式細胞儀檢測 用0.125%胰酶消化培養(yǎng)瓶內(nèi)的細胞,，離心收集，4％多聚甲醛固定30min,，PBS洗滌3遍后按1.2.5的方法行免疫熒光染色,，用流式細胞儀(FACstar PLUS型， Becton Dickison公司,，美國)檢測,，每組取3個樣本，每樣本計數(shù)10000個細胞,。
1.2.8 統(tǒng)計學處理 結(jié)果以X±s表示,，采用單因素方差分析進行統(tǒng)計學處理。
2 結(jié)果
2.1 Western Blot檢測轉(zhuǎn)染基因的表達結(jié)果 Western Blot結(jié)果顯示,，轉(zhuǎn)染了NOV cDNA的COS-7細胞CM和細胞裂解液中均可檢測到NOV陽性表達(Fig 1),。
Fig 1A: Differentiated 7 d in control group under a phase contrast microscope. B:Differentiated 7 d in NOV-CM group under a phase contrast microscope.C:NF-200 positive cells with SABC-Nickel ammonium sulfate staining 7 d after differentiated in control group.D:NF-200 positive cells with SABC-Nickel ammonium sulfate staining 7 d after differentiated in NOV-CM group.E:GFAP positive cells with SABC-Nickel ammonium sulfate staining 7 d after differentiated in control group. F:Gal positive cells with SABC-DAB staining 7 d after differentiated in control group.
2.2 液閃結(jié)果 液閃計數(shù)檢測顯示，COS-CM組和NOV-CM組的HNSCs的cpm值較對照組有明顯的增加(P<0.01),，即COS-CM和NOV-CM均能明顯促進培養(yǎng)HNSCs對3H-TdR的攝入,，說明COS-CM和NOV-CM均能明顯促進HNSCs的增殖。其中NOV-CM組的cpm比COS-CM組要高(P<0.05)，說明NOV-CM中含有促進HNSCs增殖的成分,。兩種因素處理24h后3H-TdR攝入的檢測結(jié)果見Tab 1,。另外,液閃結(jié)果也顯示NOV-CM的促HNSCs增殖作用具有一定的量效關(guān)系，在NOV-CM占換液量1/3以上時就能明顯地促進HNSCs對3H-TdR的攝入,，隨換液中CM比例的增加,，cpm值也越大，檢測結(jié)果見Tab 2,。
Tab 1 Effects of two CMs on the proliferation of HNSCs
Group n cpm
Control 8 3684±280
COS-CM 8 4958±184**
NOV-CM 8 6185±339**＃
**：P<0.01 vs control,；＃：P<0.05 vs COS-CM
Tab 2 Relation between concentration and effects of NOV-CM on promoting proliferation of NSCs
Group n cpm
Control 8 3684±280
1/3 8 5121±184**
1/2 8 6185±339**
T 8 7512±362**
**：P<0.01 vs control
N: Normal; 1/3: 1/3 NOV-CM; 1/2: 1/2 NOV-CM; T: Total NOV-CM
2.3 HNSCs分化的形態(tài)學觀察 在相差顯微鏡下，各組培養(yǎng)孔在分化第7天和14天在HNSCs球周圍均可見到三種類型的細胞：(1)具有多個粗長突起的星形膠質(zhì)細胞樣細胞,，細胞體較大,，排列緊密，折光性弱,； (2)具有一兩個或多個突起,，胞體呈圓形或橢圓形的神經(jīng)元樣細胞，細胞體較小,，突起短而少,，細胞排列疏松，折光性強,；(3)具有多個細突起且不斷分枝的少突膠質(zhì)細胞樣細胞,，細胞體較小。星形膠質(zhì)細胞樣細胞和神經(jīng)元樣細胞一般圍繞著HNSCs球呈放射狀排列,，少突膠質(zhì)細胞樣細胞一般在位于分化細胞的最外面單獨分布或成群分布,。在對照組和COS-CM組培養(yǎng)孔可見到較多星形膠質(zhì)細胞樣細胞，在它們中間或細胞上可見到神經(jīng)元樣細胞,，在NOV-CM組可見到較多的神經(jīng)元樣細胞(Fig 2A,B),。
Fig 2 Western Blot of NOV protein in COS-7 cell and NOV/COS-7 cell. A：COS-7lysis buffer；B：COS-7 cell CM,；C：NOV/COS-7lysis buffer,；C：NOV/COS-7 cell CM
2.4 免疫細胞化學和免疫熒光染色結(jié)果 染色結(jié)果證實了上述形態(tài)學結(jié)果，在各組均可見有NF-200,，GFAP和Gal陽性細胞,。NF-200陽性細胞胞體較小，染色深,；GFAP陽性細胞,，胞體較大，染色較淺,；Gal陽性細胞胞體較小,，染色較深。在NOV-CM組可見到較多的NF-200陽性細胞，細胞突起較長,，互相連接成網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu),，在對照組和COS-CM組可見到大量GFAP陽性細胞（Fig2C,D,E,G）。
2.5 流式細胞儀檢測結(jié)果 結(jié)果顯示在對照組中GFAP陽性細胞數(shù)量較多,，加入COS-CM后GFAP陽性細胞和NF-200陽性細胞數(shù)量未見明顯變化（P>0.05）,；NOV-CM組GFAP陽性細胞數(shù)量明顯減少，NF-200陽性細胞數(shù)量明顯增加（P<0.05）,；各組之間少突膠質(zhì)細胞數(shù)量相差不顯著（P>0.05）,。具體結(jié)果見表3。
Tab 3 Counts of differentiation of NSCs using flow cytometry
NF-200 GFAP Gal
Group n
7 d 14 d 7 d 14 d 7 d 14 d
Control 3 35.68±3.05 21.74±2.47 47.63±3.24 59.78±4.06 5.47±0.73 7.35±0.78
COS-CM 3 36.74±3.47 23.35±3.58 49.38±2.74 63.54±3.75 5.26±0.82 8.08±0.98
NOV-CM 3 56.85±4.36* 40.95±3.60* 38.65±2.96* 47.40±5.52* 6.04±0.72 5.46±0.87
*：P<0.05 vs control
3 討 論
自從1992年NSCs分離,、培養(yǎng)成功后,，就成為神經(jīng)科學研究領(lǐng)域中的熱點。研究證實在人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)也存在NSCs[5~7] ,，我們也已成功培養(yǎng)了HNSCs[8],。NSCs的基礎(chǔ)資料如其增殖和分化及調(diào)控機理,，成為人們需要研究的首要問題,。它可以為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和調(diào)控提供有價值的資料，并可為NSCs的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù),。許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如帕金森病,、Alzheimer’s病、損傷等都有大量的神經(jīng)元退變和丟失,，至今尚無有效的治療措施,。NSCs在體內(nèi)和體外均能被誘導分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞,。如果我們用人為的因素進行干預,，首先促進NSCs增殖，然后誘導NSCs向神經(jīng)元方向分化或者增加分化成神經(jīng)元的比例,，NSCs移植有望成為治療多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)棘手疾病的理想方法,。NSCs的分化可能存在外來信號調(diào)控和細胞自身基因調(diào)控兩種機制[13]。外來信號中,，NSCs的生存微環(huán)境決定了干細胞的分化命運,。即使同一來源的NSCs移植到不同的分化部位后其分化結(jié)果也不相同，但均與接受移植部位的細胞相似,，這一現(xiàn)象提示了外來信號調(diào)控作用的重要性[14],。目前研究表明，胰島素,、胰島素樣生長因子-I(insulin like growth factor,，IGF-I )、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)的BMP-2和BMP-4可刺激神經(jīng)元的發(fā)生[15],；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)可刺激神經(jīng)元前體細胞分裂,，但在促進細胞分化中的作用還不確定；睫狀神經(jīng)細胞營養(yǎng)因子(CNTF)作用于鼠的干細胞,，使其向星形膠質(zhì)細胞分化,，而在人胚中CNTF則促進NSCs分化成神經(jīng)元；血小板源性生長因子(PDGF)則明顯減少人胚胎NSCs分化成神經(jīng)元的比例,，這與在鼠中觀察的結(jié)果也相反,；視黃酸(RA)可以提高NSCs內(nèi)p21表達，使NSCs退出細胞周期,，進入分化,，成為神經(jīng)元[16]。本實驗利用分離培養(yǎng)成功的HNSCs,，用COS-CM和NOV-CM誘導其分化,，以觀察NOV蛋白對HNSCs分化的作用。流式細胞儀和免疫細胞化學結(jié)果顯示COS-CM對HNSCs的分化作用不顯著,，而NOV-CM可促進HNSCs向神經(jīng)元方向分化,。分化出來的神經(jīng)元突起較長，提示NOV蛋白除了促進HNSCs向神經(jīng)元分化,，還可能對新分化來的神經(jīng)元的突起生長有一定的促進作用,，此結(jié)果與我們以前在大鼠NSCs上的結(jié)果相類似[17]。
NOV蛋白是一種胰島素樣生長因子(IGF)結(jié)合蛋白,，屬于IGF家族的成員,。它通過調(diào)節(jié)IGF與IGF受體的結(jié)合狀態(tài)而對IGF的功能發(fā)揮調(diào)控作用[18]。NOV可能是通過調(diào)節(jié)IGF的作用來影響NSCs的分化,，也可能NOV本身也有促進NSCs向神經(jīng)元方向分化的作用,。我們以前研究的一些線索顯示NOV基因可能參與CNS損傷后的再生和修復過程[9, 10]，提示可以將NSCs和NOV進行聯(lián)合應(yīng)用,，從而促進CNS損傷的修復,。但在HNSCs應(yīng)用于臨床之前仍有大量的研究工作需要進行。
[參考文獻]
[1]Wozniak K. Multipotent stem cells in adult mammalian central nervous system[J]. Folia Morphol Warsz, 1999, 58(3 suppl 2):57-68.
[2]Rubio FJ, Bueno C, Villa A, et al. Genetically perpetuated human neural stem cells engraft and differentiate into the adult mammalian brain[J]. Mol Cell Neurosci, 2000, 16(1):1-13.
[3]Gage FH. Mammalian neural stem cells[J]. Science, 2000, 287(5457):1433-1438.
[4]Johansson CB, Momma S, Clarke DL, et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system[J]. Cell, 1999, 96(1):25-34.
[5]Johansson CB, Svensson M, Wallstedt L, et al. Neural stem cells in the adult human brain[J]. Exp Cell Res, 1999, 253(2):733-736.
[6]Svendsen CN, Caldwell MA, Ostenfeld T. Human neural stem cells: isolation, expansion and transplantation[J]. Brain Pathol, 1999, 9(3):499-513.
[7]Vescovi AL, Parati EA, Gritti A, et al. Isolation and cloning of multipotential stem cells from the embryonic human CNS and establishment of transplantable human neural stem cell lines by epigenetic stimulation[J]. Exp Neurol, 1999, 156(1):71-83.
[8]李巍,，蔡文琴,，吳康等。人胚胎大腦皮層神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng)[J].解剖學報,，2002,；33(3)：241-243.
[9]Su BY, Cai WQ, Zhang CG, et al. The expression of ccn3 (nov) RNA and protein in the rat central nervous system is developmentally regulated[J]. Mol Pathol, 2001, 54(3): 184-191.
[10]Su BY, Cai WQ, Zhang CG, et al. A developmental study of novH gene expression in human central nervous system[J]. C-R-Acad-Sci-III, 1998, 321(11): 883-892
[11]盧圣棟主編. 現(xiàn)代分子生物學技術(shù)[M]. 第2版. 北京: 中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社.1999.
[12]蔡文琴, 王伯沄. 實用免疫細胞化學與核酸分子雜交[M]. 成都: 四川科學技術(shù)出版社. 1994: 61.
[13]Brannen CL, Sugaya SO. In vitro differentiation of multipotent human neural progenitors in serum-free medium[J]. Neuroreport, 2000, 11(5): 1123-1128.
[14]Meltzer H, Hatton JD, Sang UH. Cell type-specific development of rodent central nervous system progenitor cells in culture[J]. J NeuroSurg, 1998, 88(1):93-98.
[15]Arsenijevic Y, Weiss S, Schneider B, et al. Insulin-like growth factor-I is necessary for neural stem cell proliferation and demonstrates distinct actions of epidermal growth factor and fibroblast growthfactor-2[J]. J Neurosci, 2001, 21(18):7194-7202.
[16]Takahashi J, Palmer TD, Gage FH. Retinoic acid and neurotrophins collaborate to regulate neurogenesis in adult-derived neural stem cell cultures[J]. J Neurobiol, 1999, 38(1): 65-81
[17]李成仁，李巍,，蔡文琴等,。NOV對大鼠神經(jīng)干細胞增殖和分化的影響[J].第三軍醫(yī)大學學報,，2003；25(1)：15-18.
[18]Kim HS, Nagalla SR, Oh Y, et al. Identification of a family of low-affinity insulin-like growth factor binding proteins (IGFBPs): characterization of connective tissue growth factor as a member of the IGFBP superfamily[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(24): 12981-12986.
