Larissa Belov, Odetta de la Vega, Cristobal G. dos Remedios,
Stephen P. Mulligan, and Richard I. Christopherson
Departments of Biochemistry [L. B., O. d. l. V., R. I. C.] and Anatomy and Histology,
Institute for Biomedical Research [C. G. d. R.], University of Sydney, NSW 2006,
and Department of Hematology, Concord Hospital, Concord, NSW 2139 [S. P. M.], Australia
不同的白血病在它們的質(zhì)膜上表達(dá)247個特定的區(qū)別抗原(CD抗原),，這些抗原可能代表了前體細(xì)胞沿著分化系統(tǒng)分化成成熟骨髓細(xì)胞和淋巴白細(xì)胞。CD抗原表達(dá)（免疫組型）在鑒定白血病上是應(yīng)用流式細(xì)胞檢測,，它一般只能辯認(rèn)三個CD抗原,。通常，結(jié)合形態(tài)學(xué),、免疫組型,、細(xì)胞化學(xué)和染色體組型方法來診斷白血病和淋巴瘤。我們已發(fā)展了一套簡單方便的方法,，它運用抗體芯片能同時檢測50甚至更多的在白細(xì)胞或白血病細(xì)胞CD抗原,。那些表達(dá)相應(yīng)的CD抗原的細(xì)胞能與芯片上的抗體結(jié)合,。對白細(xì)胞數(shù)目急劇上升的患者,，相應(yīng)的表達(dá)模式表現(xiàn)出這些細(xì)胞的免疫組型。對疾病早期患者,，根據(jù)與正常白血球不同的表達(dá)模式來診斷疾病,。人們已經(jīng)在正常外周血白細(xì)胞、慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）,、毛細(xì)胞白血病、斗篷細(xì)胞淋巴瘤、急性骨髓白血病,，以及T細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞白血病上獲得了獨特的表達(dá)模式,。在CLL細(xì)胞上的CD抗原的表達(dá)模式來自20個患者，這些患者按細(xì)胞結(jié)合的遞減次序依次為CD44, HLA-DR, CD37, CD19, CD20, CD5, CD52, CD45RA, CD22, CD24, CD45, CD23, CD21, CD71, CD11c, 和 CD9,。 能辨別CLL與正常外周血白細(xì)胞最好的抗原是CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, 和 CD37,。48個CD抗原的表達(dá)分析比流式細(xì)胞分析更為有優(yōu)勢。芯片能進(jìn)行廣泛的免疫組型分析,，以及結(jié)合到抗體芯片上的細(xì)胞可以進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定,，如使用可溶性的、熒光標(biāo)記的抗體,。
引言
血液細(xì)胞起源于干細(xì)胞,。干細(xì)胞可在細(xì)胞因子如集落刺激因子的控制下，分化及增生擴(kuò)散成骨髓與淋巴系統(tǒng)(1,2),。不同起源的前體細(xì)胞表達(dá)不同的表面分子,，其中大部分表面分子，現(xiàn)在被定義為CD抗原,。白細(xì)胞質(zhì)膜上CD抗原與各種各樣的生理功能相關(guān),，如細(xì)胞之間的相互作用，細(xì)胞因子受體,，細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo),，離子通道，轉(zhuǎn)運蛋白,，酶,，免疫球蛋白以及各種支持分子（2）。當(dāng)細(xì)胞隨特定的系統(tǒng)分化時,，CD 抗原的表達(dá)也隨之變化,，比如當(dāng)表達(dá)CD43的骨髓干細(xì)胞分化成粒性白細(xì)胞時，接著開始表達(dá)CD13和CD33,，并抑制CD34的表達(dá),。成熟的嗜中性粒細(xì)胞表達(dá)抗原CD11b,CD13,CD15,CD33的表達(dá)基本上被抑制了。白細(xì)胞的CD抗原的表達(dá)通常是根據(jù)流式細(xì)胞儀來檢測,。但是,，流式細(xì)胞檢測方法耗體力，價錢昂貴,，需要熒光性標(biāo)記的抗體,，而且一次性只能分析3-4個CD抗原。
白血病的主要類型有源自未成熟T或B淋巴細(xì)胞的ALL,，源自未成熟骨髓細(xì)胞的AML,，源自成熟B淋巴細(xì)胞的CLL,，源自粒細(xì)胞前身的慢性骨髓白血病（5）,。由于循環(huán)的淋巴瘤細(xì)胞,，NHL也被認(rèn)為是一種白血病（5）,。準(zhǔn)確的血液診斷使我們可以選擇最有效的治療手段,。目前，對急性白血病的診斷是根據(jù)對原始血細(xì)胞的形態(tài)學(xué)與細(xì)胞化學(xué)的分析,，通常還要補充染色體組型及免疫組型的分析（5）,。應(yīng)用單克隆抗體對白血病進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，對骨髓和淋巴急性白血病的診斷能達(dá)到98%的準(zhǔn)確性（9）,，能區(qū)分一系列的慢性白血病與淋巴瘤（5）,。根據(jù)WHO/FAB的標(biāo)準(zhǔn)，基于形態(tài)學(xué)分析,，CLL可分為典型與非典型兩個亞型（6,，7），這有重要的預(yù)后意義,。有很多研究表明,，非典型的形態(tài)學(xué)，三體12和異常的免疫組型有很強的一致性（10）,。
在AML中,，突變可以引起發(fā)育改變，導(dǎo)致在特定分化期終止分化細(xì)胞的增殖,?；蛘撸珹ML起因于以特殊方式分化的白血病干細(xì)胞（11）,。使用WHO/FAB的分類標(biāo)準(zhǔn),，根據(jù)形態(tài)學(xué)，與過氧化物酶和蘇丹黑染料的反應(yīng),，CD13,、CD14、CD33,、CD41,、CD61和血型糖蛋白A的表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)顆粒的類型,，奧爾棒,，液泡,，染色體位移（8,；21 或 15；17），染色體16的倒置,，11q23異常,，非特異的酯酶和氯代醋酸鹽酯酶活性，血清和尿中溶解酵素水平和周期的acid schiff 染色,，AML被分為很多亞型（6,，12）。Jennings和Food（4）綜述了基于抗原表達(dá)的模式與強度,，流式細(xì)胞儀在白血病和淋巴瘤上的應(yīng)用,。他們發(fā)現(xiàn)有限的免疫組型不能獨特的定義FAB分類的AML。然而,，50-100個抗原表達(dá)的篩選會產(chǎn)生與現(xiàn)存分類相一致的占多數(shù)的模式,。同時，它為WHO骨髓瘤形成的分類的生物學(xué)水平上的相關(guān)修改提供了方便（6）,。Bain（5）發(fā)現(xiàn)AML的8個不同的FAB亞型,，其9個表面抗原的不同的表達(dá)水平。對ALL來說,，免疫組型在分辨臨床上相關(guān)的亞型起著重要的作用,。WHO認(rèn)為ALL應(yīng)根據(jù)細(xì)胞與一組血統(tǒng)相關(guān)的抗體的反應(yīng)的模式來分類（6）。
Golub 等（13）使用DNA芯片技術(shù)對來自38個患者骨髓的AML和ALL進(jìn)行了基因表達(dá)研究,。 對6817個基因進(jìn)行了定量分析,，大約有1100個基因在AML與ALL之間是差異表達(dá)的。50個基因與AML-ALL差異是緊密相關(guān)的,，它們被用來對新樣品進(jìn)行更高精確的分類,。Alizadeh等（14）使用一個含有17856個cDNA克隆的“Lymphochip” 對96個正常與惡性淋巴細(xì)胞樣品的擴(kuò)散大B細(xì)胞淋巴瘤的基因表達(dá)進(jìn)行分析。鑒定出兩種不同形式的淋巴瘤,，它們的表達(dá)模式表明B細(xì)胞分化的不同階段,。寡核苷酸芯片在分類白血病或淋巴瘤中的使用，操作是實驗式與復(fù)雜的,，與現(xiàn)在的診斷標(biāo)準(zhǔn)（形態(tài)學(xué),，免疫組型，細(xì)胞化學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)）很難協(xié)調(diào),，缺乏臨床上的相關(guān)性,。而且，在mRNA與蛋白水平以及而后的翻譯后修飾,，還存在著不確定的關(guān)系,。
Chang（15）證明了人外周血單核細(xì)胞與吸附于玻片上的小鼠抗人HLA-A2抗體（50nl）特異性結(jié)合，以及小鼠胸腺細(xì)胞與類似固定的抗
Lyt 2.1和抗Lyt 2.2的抗體結(jié)合,。這種利用固定化的抗體來鑒定HLA抗原的同種抗免疫球蛋白的潛能,，以及白細(xì)胞子集的比例已進(jìn)行了廣泛的討論,。但在這個程序上并沒有相當(dāng)大的發(fā)展。我們對這個方法進(jìn)行了檢測,，我們把抗CD3,，CD4，CD8,，和CD19的抗體點在玻片上,，然后與人Raji(B細(xì)胞Burkitt淋巴瘤)或CCRF-CEM（T細(xì)胞ALL）進(jìn)行雜交。因此,，我們發(fā)展了抗體芯片,，稱為LD芯片（紀(jì)念Lee Dixon）。
材料與方法
細(xì)胞系
從American Type Culture Collection (Manassas, VA)獲得CCRF-CEM（急性成淋巴細(xì)胞白血?。?，Raji（Burkitt 淋巴瘤），以及HL-60（急性髓細(xì)胞前身白血?。?，并在RPMI 1640 培養(yǎng)基（Trace Scientific, Melbourne, Victoria, Australia）上生長。該培養(yǎng)基還添加有10%小牛血清(CSL Limited, Parkville, Victoria,Australia)和50 mg/ml 慶大霉素硫酸鹽(Life Technologies, Inc., Grand Island, NY),。
抗體芯片的構(gòu)建
這個程序已在PCT的申請中提到,。PixSys 3200 Aspirate and Dispense System (Cartesian Technologies, Irvine, CA)被用來構(gòu)建一個矩形芯片（0.72cm×0.4cm），首先在載玻片（Fast Slides, Schleicher and Schuell）上固定上一層硝化纖維膜,，再點上60個不同的5nl的抗體,，然后涼干?？贵w是從下列公司購買：Coulter and Immunotech from Beckman Coulter (Gladesville, NSW, Australia), PharMingen from BD Biosciences (North Ryde, NSW, Australia), and Biosource International from Monarch Medical (Stafford City, Queensland, Australia). 這些抗體是于-20℃保存在0.1%BSA中（Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia）,使用濃度在25-1000 mg/ml,。在白光盒上我們用肉眼可以看到抗體圓點，芯片的角落用鉛筆標(biāo)記,。硝化纖維膜用含5% (w/v)奶粉(Diploma; Bonlac Foods, Melbourne, Victoria, Australia)PBS緩沖液封閉（室溫下90min ）,再用水洗滌,，干燥，于4℃枯燥保存,。每一批芯片都要用細(xì)胞系和冷凍的外周血白細(xì)胞或知道顯型的白血病細(xì)胞,，來檢測抗體結(jié)合的活性。
白細(xì)胞與LD芯片的結(jié)合
正常人與白血病患者的外周血中分離白細(xì)胞（用EDTA或肝磷脂防止血液凝結(jié)）,。首先使用Histopaque(Sigma Aldrich),作PBS洗滌,，再用含1mM的EDTA的PBS重懸，使細(xì)胞達(dá)到 107個/ml,，然后與LD芯片在室溫下溫浴30分鐘（100ml懸浮液/片）,，沒有結(jié)合上的細(xì)胞會被PBS柔和的洗滌掉。EDTA能明顯的降低非特異性結(jié)合,。熱失活的人AB血清[10%（v/v）,；Sigma-Aldrich]添加到AML細(xì)胞中,，由于Fc受體結(jié)合，與所有的抗體結(jié)合,。芯片再在含1%（v/v）甲醛（(Sigma-Aldrich),，2%（w/v）葡萄糖,，以及0.05%（w/v）疊氮化鈉的PBS中固定1h,然后再用PBS洗滌,。
數(shù)據(jù)記錄與分析
使用非常規(guī)的暗視野顯微鏡（如帶UPLan 4×物鏡的Olympus BX60 熒光顯微鏡），觀察結(jié)合的白細(xì)胞,。冷凝器安置在階段1位置,，綠色濾光片固定在光源上。使用SenSys digital cooled CCD camera (1317×1035 pixels; Photometrics, Tucson, Arizona), PCI Frame Grabber, and “V” version 3.5 圖象處理與分析軟件（Digital Optics, Auckland, New Zealand）對圖象進(jìn)行記錄和分析,。使用Adobe Photoshop version 5.0 軟件對圖象進(jìn)行處理,比較一套標(biāo)準(zhǔn)的強度漸增的矩陣來計算點密度,。使用ImageQuant version 3.3軟件進(jìn)行量化分析。固定的芯片即使干燥以后,，如果用PBS弄濕的話,，重新可以在顯微鏡下觀察。
流式細(xì)胞分析
分離出來的外周血白細(xì)胞（106個細(xì)胞）與FITC-或PE-結(jié)合的抗體（Coulter or Immunotech）,，以及2%（v/v）熱滅活的人AB血清（Sigma-Aldrich）在室溫下溫浴15分鐘,。用FACS緩沖液（含0.1% (w/v) BSA 和 0.1% (w/v) sodium azide的PBS）洗滌后，細(xì)胞用定色劑重懸,，在FACS-calibur flow cytometer上分析,，用488納米冷氬離子激光，運行CELLQuest 軟件（Becton Dickinson, San Jose, CA）,。
共聚焦顯微觀察
與白細(xì)胞溫浴后,，LD芯片再與CD3-FITC (Coulter; diluted 1 in 200 with FACS buffer) 和 CD19-PE (Immunotech; undiluted) 1:1 混合的混合物于室溫下溫浴10分鐘。使用FITC-和PE-結(jié)合的同型對照抗體進(jìn)行特異性的結(jié)合的檢測,。玻片再用PBS緩沖液洗滌,用SlowFade Antifade Kit (Molecular Probes; from Bioscientific, Gymea, Australia)進(jìn)行固定,。使用Leica TCS NT Confocal System (Microsystems, Heidelberg, Germany) 的Plan Opo 100×1.40–0.7 oil immersion objective，對玻片進(jìn)行檢測,。使用Adobe Photoshop version 5.0 軟件對圖象進(jìn)行處理分析,。
結(jié)果
結(jié)果
預(yù)備實驗表明，多余的細(xì)胞聚合體和非特異結(jié)合的白細(xì)胞可通過以下方法降到最低：洗滌細(xì)胞以除去外在的營養(yǎng)物,；添加螯合劑（EDTA）,；把溫浴溫度從37℃降到22℃。在這樣的條件下,，很少甚至沒有細(xì)胞聚合體在抗體芯片上被檢測到,，背景很低甚至沒有。
圖1 表示三個獨特的細(xì)胞系與含60個抗體點的芯片雜交的模式,并用非常規(guī)的暗視野顯微鏡觀察,。雜交點的強度反映了與特定位置上抗體結(jié)合的細(xì)胞的密度(Fig. 1a),。CCRF-CEM 細(xì)胞與抗體如CD4, CD5, CD7, CD8, CD38, CD44, CD45,CD45RO, CD71, 和 CD95 上有較高的雜交信號,，但與CD3 和 CD52 信號較低(Fig. 1b). Raji細(xì)胞與CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD37, CD38, CD45, CD45RA, CD52, CD71, CD79b, CD80, 和 CD95有較高的雜交信號；與sIg的雜交信號適中,；與CD154, k 雜交信號較低(Fig. 1c). HL-60與CD4, CD13, CD33, CD44, CD64, CD71, 和CD117雜交信號較高,；與 CD11b, CD11c, CD15, CD38, CD45, CD45RO, CD95, 和 KOR (CD66c)雜交信號適中；與CD8, CD14, 和 CD16 雜交信號較低(Fig.1C),。圖2說明,，當(dāng)Raji細(xì)胞（密度107 cell/ml）結(jié)合于HLA-DR和CD38抗體時，在樣品的細(xì)胞密度與結(jié)合細(xì)胞的數(shù)量存在著線形關(guān)系,。當(dāng)樣品的細(xì)胞在6×105 cell/ml時,很少甚至沒有雜交信號被檢測到,。
圖3顯示從正常組織與各種白血病病人的白細(xì)胞的雜交模式。正常外周血白細(xì)胞與30多個抗體有雜交信號,?？筎細(xì)胞抗原的抗體（CD2, CD3, CD4, CD5,CD7）比抗B細(xì)胞抗原的抗體（CD19, CD20, CD21, CD22,CD23 和 CD24）能結(jié)合更多的細(xì)胞，反應(yīng)為T淋巴細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞之比為70:30,它們占了外周血白細(xì)胞的20-40%（17）,?？笴D44與CD52的抗體與白細(xì)胞高強度結(jié)合，這在大多數(shù)白細(xì)胞中是一致,。白細(xì)胞與CD13和CD33結(jié)合強度適中,，反映出單核細(xì)胞/粒細(xì)胞在外周血中的濃度（>40%白細(xì)胞）?？笴D41和CD42a的抗體與血小板結(jié)合,，同時抗glycophorin A（CD235a）與紅細(xì)胞結(jié)合。在新鮮的白細(xì)胞準(zhǔn)備液中都發(fā)現(xiàn)這兩個類型細(xì)胞的存在,。
CLL病人中含有大量白細(xì)胞的樣品 (>30×109cells/liter),，陽性斑點較少(<25; Fig. 3c)，密度均一,，反映了單克隆CLL細(xì)胞相對于正常白細(xì)胞的優(yōu)勢(4–10×109cells/liter; Ref. 17),。對于白細(xì)胞數(shù)較少的CLL病人來說(8–14×109cells/liter; Fig. 3d)，其結(jié)合模式仍然可以與正常白細(xì)胞相區(qū)別,，因為對應(yīng)于B細(xì)胞抗原的點密度要大于或等于T細(xì)胞的點,。我們還沒有檢測白細(xì)胞數(shù)小于8×109cells/liter的CLL病人，但是當(dāng)CLL細(xì)胞和正常白細(xì)胞以1：3相混合（相當(dāng)于血液白細(xì)胞總數(shù)5×109cells/liter）時CLL的模式仍然是明顯的,，提示LD array可用于檢測較早期的白血病或淋巴瘤,。
來自于一個HCL病人的白細(xì)胞(Fig. 3e)與抗CD103和FMC-7緊密結(jié)合，而不是CD23和CD5,，與典型的HCL免疫表型相一致,，從而與CLL區(qū)分開來。與抗CD5結(jié)合的小量細(xì)胞用可溶性抗CD3和抗CD20熒光標(biāo)記后經(jīng)共聚焦顯微鏡檢測證明是T細(xì)胞。NHL(Fig. 3f)與CLL和HCL相比,，具有B細(xì)胞免疫表型(CD51/ CD79b1/CD1032/FMC-71),。AML病人的白細(xì)胞模式是雙表型的(Fig. 3f)，除了單細(xì)胞譜系抗原(CD4, CD11b, CD33, CD36, CD38, CD64, and HLA-DR)的表達(dá)外,，還有T淋巴細(xì)胞標(biāo)記CD2的表達(dá),。該免疫表型通過流式細(xì)胞儀確證。所有的白細(xì)胞都有T細(xì)胞免疫表型(Fig. 3h),。從LD微陣列獲得的HCL, NHL, 和T-ALL (Fig. 3, e, f, and h)的免疫表型和由病理實驗室提供的流式細(xì)胞數(shù)據(jù)非常吻合,。
用LD array確定的兩個CLL病人白細(xì)胞中48個抗原的表達(dá)與流式細(xì)胞儀非常接近（表1），尤其是高水平表達(dá)的抗原,。當(dāng)FACS分析顯示總?cè)后w的75–100%有抗原表達(dá)(CD5, CD19, CD20, CD24, CD37, CD44, CD45RA, CD52, and HLA-DR; patient 7),，即表示發(fā)生了高水平的結(jié)合,。35–75%的表達(dá)(CD9, CD11b, and CD21; patient 7)與中度結(jié)合相關(guān),，而15–35%的細(xì)胞表達(dá)抗原結(jié)合較弱(CD22, CD45RA, CD79a, and GPA; patient 8)。當(dāng)FACS顯示只有0–15%細(xì)胞陽性時結(jié)合通常是負(fù)的或+/-,。有些情況下,，細(xì)胞結(jié)合的FACS結(jié)果要比預(yù)期的低(CD11c, CD79a, CD95, and CD154 for patient 7)，常常反映了這些抗原的低表達(dá),。然而,，抗原低表達(dá)也不總是與弱結(jié)合相關(guān)的，提示有些抗體(CD22, CD23, and CD71 for patient 8)結(jié)合細(xì)胞的能力遠(yuǎn)比其它抗體強,，盡管這些強結(jié)合抗體使用時的濃度(25 or 50 mg/ml)要比其它的(200 mg/ml)低,。有些點顯示+/-細(xì)胞結(jié)合的，在FACS結(jié)果中卻是負(fù)的(CD2, CD7, CD9, CD103, CD117, and CD122 for patient 8),，提示較小細(xì)胞亞群的檢測用點陣列(106cells/array)而不是FACS(5000 cells counted),。但是這些結(jié)果應(yīng)被謹(jǐn)慎對待，因為一個+/-結(jié)果代表了<50 cells/antibody dot,，可能不是十分重要的,。
用LD array分別分析凍存及新鮮分離的正常白細(xì)胞或白血病細(xì)胞，得到可比的點陣模式,。但是來自凍存細(xì)胞的一些抗體(CD9, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD56, CD57, CD79a, CD95, and CD154)偶爾會有負(fù)結(jié)果,，提示可能由于這些抗原表面脫落或抗原決定簇破壞導(dǎo)致了結(jié)合力降低甚至喪失。根據(jù)LD array分析,，盡管凍存細(xì)胞丟失了一些抗原,，抗體的多功能平板也允許樣品間在點陣模式上有變化，而一致模式上診斷不變,。
來自20個CLL病人的白細(xì)胞樣品和來自20個正常樣品相比,，其點陣模式顯著不同，如圖4,。正常和CLL的白細(xì)胞間有28個抗原差異顯著（P>0.0005）,，以星號標(biāo)出,。CLL白細(xì)胞抗原表達(dá)的一致模式按細(xì)胞結(jié)合的降序排列依次為：CD44, HLA-DR, CD37, CD19, CD20, CD5, CD52, CD45RA, CD22, CD24, CD45, CD23, CD21, CD11c, sIg, and CD71。κ和λ輕鏈表達(dá)詮釋了白血病單克隆性,。能夠最好區(qū)別CLL和正常外周血白細(xì)胞的抗原是CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24和CD37,。此外，CLL樣品對特異性結(jié)合T細(xì)胞(CD2, CD3, CD4, and CD7)和各種骨髓細(xì)胞(CD4, CD11b, CD13, CD14, CD16, CD32, CD33, CD36, CD41, CD42a, CD61, and CD64)的抗體的結(jié)合力顯著減弱,，反映了白血病B細(xì)胞與正常白細(xì)胞的高比值,。與此相一致，部分CLL樣品對細(xì)胞表面標(biāo)記如CD9, CD11b, CD11c, CD25, CD38, CD45RO, CD71, CD79a, CD79b, CD80, CD122, FMC-7, 和FLT3 (CD135)等是陽性的,。兩個對CD23陰性,。正常外周血白細(xì)胞的血小板相對較高，可通過顯微鏡觀察抗體對CD9, CD36, CD41, CD42a, CD60, and CD61 (Fig. 3b)很容易識別出來,。白血病病人的樣品通常血小板較低,，反映了血液中這類細(xì)胞的比例較低(Fig. 3, c–h)。
在有些樣品中,，GPA點揭示了RBC(Fig. 3, e and f)污染,。隨后又有顯示，用滲透裂解法（裂解液0.15 M ammonium chloride/10 mM potassium hydrogen carbonate/ 0.1 mM EDTA）從制備的白細(xì)胞中去除RBC以后,，白細(xì)胞的結(jié)合模式?jīng)]有顯著改變,。
Fig. 1. Binding patterns of human cell lines using the LD Array. a, key to antibody identification; b, CCRF-CEM; c, Raji; d, HL-60. The numbers in the antibody key refer to antibodies against the corresponding CD antigens; mIgG1 and mIgG2a are murine isotype control antibodies; 44 v3–10 and 44 v6 are antibodies against CD44 variants 3–10 and 6; k, l, GPA, HLA-DR, KOR, FMC7, and sIg are antibodies against human k and l light chains, GPA (CD235a), HLA-DR, KOR-SA3544 antigen (CD66c), FMC-7, and surface immunoglobulin.
Fig. 2. Relationship between cell density of the sample and number of cells binding to antibody dots on LD Arrays. Serial 2-fold dilutions of a suspension of Raji cells (107 cells/ml) were tested on LD Arrays. The number of cells bound to antibody dots for HLA-DR (f) and CD38 (F) are plotted against the density of cell suspensions. Regression analysis of data for HLA-DR (OOO) and CD38 (——) gave coefficients of correlation (R2) of 0.97 and 0.96, respectively.
Fig. 3. Binding patterns of human leukocytes using the LD Array. The leukocyte abbreviation, source, and cell density of the sample appear in brackets. a, key to antibody identification; b,normal peripheral blood leukocytes (subject 1; 4x109 cells/liter); c, CLL (patient 1; 30x109 cells/liter); d, CLL (patient 2; 9x109/liter); e, HCL (patient 3; 16x109 cells/liter); f, mantle cell lymphoma (patient 4; 19x109 cells/liter); g, AML (patient 5; 190x109 cells/liter); h, T-cell ALL (patient 6; 17x 109 cells/liter). The numbers in the antibody key refer to antibodies against the corresponding CD antigens as defined in the legend to Fig.1.
Table 1 Comparison of LD Array and flow cytometric analyses for two CLL samples Dot array results are expressed as level of cell binding to each antibody dot: 2 (none), 1/2 (very low), 1 (low), 11 (moderate), 111 (high), 1111 (very high). Flow cytometric analysis results are expressed as percentage of cells showing fluorescence for each antigen. The (1/2) to (111) results shown in brackets denote intensity of fluorescence compared to cells with control antibody (FITC- or PE-conjugated murine IgG1).
Fig. 4. Immunophenotypes of normal peripheral blood leukocytes and CLL cells. Leukocytes from peripheral blood of 20 normal individuals and 20
CLL patients (with leukocyte counts ranging from 8x109/liter to 250x109/liter) were tested using the LD Array, and the density of cell binding was scored by comparison with a set of standard dots of increasing intensity, as shown in the inset. The average values for CLL cells were calculated for each antibody and are plotted in descending order (black bars). The average values for normal peripheral blood leukocytes are also shown (gray bars). Statistical significance (P , 0.0005) of differences between CLL and normal peripheral blood leukocytes was determined by two-sample Student’s t test assuming equal variances and is shown by an asterisk (p).
Fig. 5. Confocal microscopy. Detection of CD3 (green fluorescence) and CD19 (red fluorescence) on leukocytes from (a, b, c) a normal individual
and (d, e, f) a CLL patient (patient 9; 13 3 109cells/ liter), bound to three different antibodies on an LD Array: a and d, anti-CD5; b and e, anti-CD7;c and f, anti-CD20. White scale bar, 10 mm. The binding of fluorescently labeled CD antibodies to cells captured on an LD Array is described in “Materials and Methods.”
來自CLL樣品的白細(xì)胞以高密度和抗CD5相結(jié)合(Fig. 3, c and d)，與已知的CLL上CD5的表達(dá)相一致,。這種結(jié)合的密度相對于CLL細(xì)胞與其它T細(xì)胞標(biāo)記（如CD7）的結(jié)合密度相比是高的,，而與B細(xì)胞標(biāo)記（如CD20）的結(jié)合密度相當(dāng)。如圖5所示,，與一個抗體點結(jié)合的細(xì)胞群體可通過標(biāo)記可溶性抗-CD3-FITC（綠色）和抗-CD19-PE （紅色）,，用共聚焦顯微鏡觀察得到進(jìn)一步驗證。正常的結(jié)合到CD5和CD7點上的外周血白細(xì)胞很明顯是T細(xì)胞(Fig. 5, a and b),，而與CD20結(jié)合的則是B細(xì)胞(Fig. 5c),。與此相比，與CD5結(jié)合的CLL細(xì)胞則是B細(xì)胞(Fig. 5d),，而在CD5和CD7上則觀察到較少量的T細(xì)胞(Fig. 5, d and e),。僅有兩個樣品的CD20結(jié)合B細(xì)胞(Fig. 5, c and f)，在CLL病人的血液中很明顯是白血病B細(xì)胞,。
討論
LD芯片可以對許多白血病樣品進(jìn)行大范圍的表面抗原的篩選,，尤其當(dāng)點陣模式的記錄和分析都是自動進(jìn)行時尤為突出。用LD芯片進(jìn)行血癌分析時,，不僅有可能識別細(xì)胞的譜系和成熟期,，而且還可能發(fā)現(xiàn)新的預(yù)兆標(biāo)記。所識別的稀有表面抗原可在化療后檢測殘留的最小疾病，同時作為人為單克隆抗體免疫療法的靶(18, 19),。
盡管LD芯片是一個強有力的工具,，它并不能提供FACS分析所得到的所有信息，如單細(xì)胞或抗原表達(dá)/細(xì)胞水平的多參數(shù)分析,。盡管LD芯片允許對顯著免疫表型細(xì)胞亞群的相對密度進(jìn)行半定量,，卻不能做到絕對的完全定量。在平衡方面,，由一個抗體點捕捉到的細(xì)胞數(shù)不僅取決于細(xì)胞數(shù)量,，還取決于反應(yīng)的親和力、點上的抗體濃度,、細(xì)胞表面抗原的表達(dá)水平,，以及固定在硝酸纖維上的抗體的空間可接近性。所計算出的對點上細(xì)胞密度（pixel intensity）的定量不僅取決于細(xì)胞數(shù),，還取決于細(xì)胞的大小和形態(tài),。LD芯片的主要優(yōu)點在于其速度和廣泛的免疫表型，使得用大型顯微抗體點陣可進(jìn)行模式識別,。盡管這些抗體液態(tài)時在4°C并不穩(wěn)定,，但LD芯片片干燥后可在4°C多保存6個月,，而其結(jié)合力沒有顯著喪失,。硝酸纖維潮濕后即變透明的本性可對結(jié)合的細(xì)胞進(jìn)行顯微檢查。如果相對外周血白細(xì)胞的背景異質(zhì)性來說,，對低密度白血病的一致點陣模式的識別被證明是有問題的,，則任何抗體點上的細(xì)胞亞群就能通過熒光顯微鏡觀察。
LD芯片現(xiàn)在被用于建立白血病診斷的抗原表達(dá)的一致模式,，而不是慢性淋巴細(xì)胞白血病CLL,。大量白血病的LD芯片結(jié)果的集合為源于血液的癌癥的模式識別診斷提供了一個數(shù)據(jù)庫。已有相關(guān)數(shù)據(jù)庫被描述為通過流式細(xì)胞儀運用免疫組型方法對血癌進(jìn)行診斷(20),。自動處理芯片,，記錄點陣模式、計算機(jī)定量以及模式識別等正在發(fā)展中,。這些過程的標(biāo)準(zhǔn)化可以將來自不同實驗室的數(shù)據(jù)集直接進(jìn)行比較,。還需要另外的工作來確定每個抗體的最佳濃度。當(dāng)前使用的抗體的濃度適用于FACS分析使用,?？梢酝ㄟ^對不同抗體濃度和/或雜交克隆的篩選來進(jìn)一步增強LD芯片的靈敏度。
CLL要么是穩(wěn)定的,，要么是增殖的(21, 22),。最近的研究將穩(wěn)定的疾病與低bcl-2/bax比值相關(guān)聯(lián)(23)，而將增殖的疾病與高血清水平的CD23和IL-8相關(guān)聯(lián)(24 –26)。然而,，嘗試將CLL免疫表型與疾病診斷相關(guān)聯(lián)則產(chǎn)生了非決定性的結(jié)果(27),。LD芯片篩選大量CLL樣品以作大范圍CD抗原表達(dá)的能力可能會識別出新的CLL亞群。此外,，對凍存白血病樣品的檢測可以發(fā)現(xiàn)免疫表型與疾病增殖之間的相互關(guān)聯(lián),。在最近的Seventh Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens (Harrogate, United Kingdom)，新發(fā)現(xiàn)的81種CD抗原被命名,，最后一個是CD247,。與這些CD抗原相對應(yīng)的單克隆抗體將很快商業(yè)化，進(jìn)一步拓展了用LD芯片分析白細(xì)胞群體的范圍,。
