譚凱 張鵬宇 王天才 唐望先 梁擴(kuò)寰
摘 要:為探討肝硬化腹水大鼠鈉潴留的發(fā)生機(jī)制，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對(duì)膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的膽 汁性肝硬化腹水大鼠和假手術(shù)大鼠腎組織內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）及誘導(dǎo)型一氧化氮合 酶（iNOS）的表達(dá)進(jìn)行比較性研究,。結(jié)果顯示二組大鼠腎組織eNOS表達(dá)無顯著性差異,，而iN OS在肝硬化腹水大鼠呈強(qiáng)陽性表達(dá)，在假手術(shù)大鼠則為陰性,。提示膽汁性肝硬化腹水大鼠腎 臟iNOS表達(dá)顯著增高,，腎臟NO途徑可能參與了肝硬化鈉潴留的發(fā)生機(jī)制。
關(guān)鍵詞:肝硬變,；腹水,；腎臟；一氧化氮合酶,；免疫組織,；化學(xué)
業(yè)已證明，NO在肝硬化全身和腎臟改變中起重要作用，NO抑制可引起高動(dòng)力循環(huán)的逆轉(zhuǎn)和腎 排泄功能的改善［1］,。然而,，直接論證實(shí)驗(yàn)型或臨床型肝硬化腎臟NO產(chǎn)生增加的文 獻(xiàn)極少 ，在國內(nèi)尚未見報(bào)道,。因而本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)法研究肝硬化腹水大鼠和假手術(shù)大鼠腎 臟一氧化氮合酶（NOS）的表達(dá),，旨在探討腎臟NO途徑是否參與了肝硬化鈉水潴留的發(fā)生機(jī) 制,。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
雄性SD大鼠,，體重為195～245 g（由同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供）。分兩組：肝硬化組 （CIR）和假手術(shù)組（SO）,。
1.2 模型制備
參照文獻(xiàn)［2］采用膽管結(jié)扎復(fù)制肝硬化模型,。氯胺酮（100 mg/kg,im）麻 醉后開腹，游離出膽管,，用絲線雙重結(jié)扎并從中剪斷,。關(guān)腹后給予長效青霉素（芐星青霉素 3萬U/只）肌注。于第28 d處死大鼠,，取少許肝組織,，用100 ml/L甲醛固定24 h。常規(guī)石蠟 包埋,，切片,。HE染色后用光學(xué)顯微鏡觀察。SO組僅分離出膽管,，不結(jié)扎和剪斷,，其余步驟同 CIR組。
1.3 取材和切片
氯胺酮麻醉后,，取3只肝硬化腹水大鼠和3只假手術(shù)大鼠腎臟,，用磷酸緩沖鹽溶液沖洗，切開 冷藏于液氮待進(jìn)一步處理,。標(biāo)本于恒溫切片機(jī)行連續(xù)冰凍切片（厚約6 μm）,，用冷丙酮 固定10 min，取出吹干,，30 min后轉(zhuǎn)入低溫冰箱保存,。
SABC法進(jìn)行NOS的免疫組化研究（試劑盒購自博士德生物工程有限公司）。室溫下切片經(jīng) 30 g/L H2O2-甲醇溶液孵育30 min,，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶及用100 g/L正常羊血清 孵育1 h,，以清除非特異性背景染色。切片直接滴加適當(dāng)稀釋的一抗（兔IgG）,，孵育48～72 h（4℃）,。再依次用生物素標(biāo)記羊抗兔IgG孵育1 h及SABC孵育1～2 h。繼用DAB顯色5～8 min。以上各步驟間均用0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次,。最后將切片貼附 在覆有明膠膜的載玻片上,，空氣干燥，以蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,，蒸餾水沖洗,，逐級(jí)酒精脫水， 二甲苯透明,，松脂膠封片,。以非免疫的正常兔血清代替一抗進(jìn)行染色作為陰性對(duì)照。
2 結(jié)果
4周后,，肝硬化組所有大鼠均出現(xiàn)顯著黃疸,、胃腸淤血、脾臟腫大及腹水,。肝臟表面呈細(xì) 顆粒狀,，被膽汁染成綠褐色。組織學(xué)檢查顯示膽汁性肝硬化特征性表現(xiàn),。研究中假手術(shù)和肝 硬化腹水大鼠腎臟eNOS均呈陽性表達(dá),，二者沒有顯著性差異。而腎臟iNOS在假手術(shù)組未見表 達(dá),，在肝硬化腹水組則呈強(qiáng)陽性表達(dá)（見圖1,、2）。
圖1 肝硬化腹水大鼠腎臟iNOS呈陽性表達(dá)(×100)
圖2 假手術(shù)大鼠腎臟iNOS未見表達(dá)(×100)
3 討論
在過去的幾十年中,，肝硬化鈉潴留的發(fā)生機(jī)制一直是眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn),，然而卻缺乏 最終的定論［3］。推測很可能是參與維持體內(nèi)鈉平衡的多個(gè)系統(tǒng)調(diào)節(jié)失衡的結(jié)果,。 最近的研究強(qiáng)有力地證明,，NO可能參與了肝硬化鈉潴留的發(fā)生機(jī)制。
NO是具有多種生物活性的物質(zhì),，它與血管擴(kuò)張,、腎功能調(diào)節(jié)、胃腸運(yùn)動(dòng),、神經(jīng)信息傳遞 ,、免疫、抗腫瘤,、血小板聚積,、蛋白質(zhì)合成等有關(guān)。已知內(nèi)源性NO是L-精氨酸（L-Arg） 在N OS催化及輔因子的作用下,，脫去胍基末端氮原子與氧結(jié)合而成,。NO產(chǎn)生后,，滲出細(xì)胞膜，經(jīng) 旁分泌形式作用于靶細(xì)胞,。NOS有三種亞型：神經(jīng)型（nNOS）,、誘導(dǎo)型（iNOS）及內(nèi)皮型（e NOS）。其中nNOS與eNOS合稱為結(jié)構(gòu)型NOS（cNOS）,，它依賴于鈣-鈣調(diào)蛋白,，正常情況存在 于神經(jīng)系統(tǒng)和血管內(nèi)皮等處；iNOS不依賴于鈣-鈣調(diào)蛋白,，在內(nèi)毒素和(或)細(xì)胞因子誘導(dǎo)下 產(chǎn)生于許多種類細(xì)胞(如血管內(nèi)皮細(xì)胞,、血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞,、肝細(xì)胞,、Kupffer細(xì)胞 ,、Ito細(xì)胞等),。
眾所周知，血管內(nèi)皮是NO產(chǎn)生的主要來源,。但近來有研究［1,，4］表明，腎臟亦有較 大的產(chǎn) 生NO的能力,。Criado等［1］證實(shí),，自膽管結(jié)扎肝硬化大鼠分離的腎小球基礎(chǔ)NO量是 增加的 ，而引起NO產(chǎn)生增加的主要原因則是iNOS的誘導(dǎo)激活,。Bosch等［5］還證明,，用四氯 化碳誘 導(dǎo)的肝硬化腹水大鼠腎臟eNOS蛋白表達(dá)顯著增加。這些結(jié)果表明,，肝硬化腹水大鼠腎臟NO產(chǎn) 生是增加的,。已有學(xué)者［6，7］通過微穿刺研究和觀察離體灌注腎發(fā)現(xiàn),，NO合成抑制 可減少腎小管鈉重吸收,，表明了NO在腎小管鈉轉(zhuǎn)運(yùn)方面的直接效應(yīng)。
新近又有學(xué)者提出［8］,，鈉水潴留的主要始動(dòng)因素是內(nèi)臟循環(huán)中的外周動(dòng)脈血管擴(kuò) 張,，它 通過激活壓力感受器介導(dǎo)的血管收縮反應(yīng)、抗鈉尿排泄反應(yīng)和制尿反應(yīng),，以相反地調(diào)節(jié)動(dòng)脈 循環(huán)的相對(duì)充盈不足,。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，肝硬化時(shí)體內(nèi)NO產(chǎn)生是增加的,，這將引起以外周動(dòng) 脈血管擴(kuò)張,、心率加快和心輸出量增高為特征的高動(dòng)力循環(huán),。另有學(xué)者［9］通過持 續(xù)使用 低劑量L-NAME觀察到，肝硬化腹水大鼠出現(xiàn)顯著的腎鈉水排泄增加和有效的負(fù)鈉平衡及腹 水減少,。
我們的研究顯示,，假手術(shù)和肝硬化腹水大鼠腎臟eNOS均呈陽性表達(dá)，二者沒有顯著性差異,。 而iNOS在肝硬化腹水大鼠腎臟呈強(qiáng)陽性表達(dá),，在假手術(shù)組則為陰性。這與Criado等人的研究 相一致,。肝硬化（尤其是膽汁性肝硬化）時(shí),，血中升高的內(nèi)毒素、TNFα及IL-1等共同作用 于多種細(xì)胞,，誘導(dǎo)產(chǎn)生iNOS,，催化生成大量NO，使得肝硬化大鼠血中及腎臟NO產(chǎn)生增加,，繼 而通過全身和局部作用來影響腎鈉排泄,。
綜上所述，在肝硬化腹水大鼠鈉水潴留的發(fā)生機(jī)制中存在著NO 途徑,。NO不僅通過作為 全身血管舒張劑代表促進(jìn)具有抗鈉性質(zhì)的內(nèi)源性血管收縮劑的活性,，而且還可通過局部作用 來直接影響腎小管的鈉排泄。
國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.39670348）
譚凱,，女,，1964年生，主治醫(yī)師
譚凱（同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院內(nèi)科,，武漢 430030）
張鵬宇（上海市第一人民醫(yī)院內(nèi)科,，上海 200080）
王天才（同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院內(nèi)科,，武漢 430030）
唐望先（同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院內(nèi)科,，武漢 430030）
梁擴(kuò)寰（同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院內(nèi)科，武漢 430030）
參考文獻(xiàn)
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