韓忠朝 馮四洲 韓明哲
造血干細胞(HSC)移植技術主要包括干細胞的鑒別,，活性測定,，干細胞的采集，分離純化,，動員,，擴增,，干細胞保存，腫瘤細胞的凈化,，干細胞改造以及干細胞操作專用儀器,、材料和試劑的開發(fā)生產(chǎn)等。
1 HSC特征 HSC在體內(nèi)多數(shù)處于G０期或休眠期,，而祖細胞則比較活躍,，在多種細胞因子或生長因子作用下能大量增殖與分化。HSC可以通過單克隆抗體檢測確定其存在,。研究發(fā)現(xiàn)CD34＋細胞群中,，90%以上的細胞為祖細胞，更原始細胞具有CD33-,、CD38-,、HLA-DR-、Thy-1＋(low),、c-kit＋(low),、Rh-123淡染或不染色，能耐受5-氟尿嘧啶的作用等特點,。CD34＋細胞約占正常骨髓單個核細胞(MNC)的1.5%,，多能造血干細胞約占骨髓MNC十萬分之一，形態(tài)學無法鑒別,。
2 不同來源干細胞的特點 HSC主要來源于骨髓,、成人外周血、臍血,。臍血有如下特點：造血干細胞含量豐富,，雖然CD34＋細胞數(shù)低于骨髓，但CD34＋CD38-細胞數(shù)高于骨髓,，且臍血CD34＋CD38-細胞增殖分化能力高于骨髓,，尤其是加入各種細胞因子后CFU-GEMM、BFU-E集落數(shù)明顯高于骨髓［1,，2］,；研究端粒時發(fā)現(xiàn)隨著年齡增長，其長度逐漸減少,，每一次細胞分裂約丟失50個堿基對,，純化的成人CD34＋CD38low和CD34＋CD71lowCD45Ralow細胞端粒較臍血及胎肝細胞短，因此認為臍血為具有很強增殖潛能的造血組織［3］,；淋巴系統(tǒng)抗原表達弱,，淋巴細胞功能不成熟，這顯示出臍血干細胞移植(UCBT)后移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生率可能較低［3］；有研究者報告,，-196℃直接凍存臍血6個月以上,，HPP-CFC、CFU-GEMM,、BFU-E,、CFU-GM回收率為80%～87%，經(jīng)分離的MNC凍存后長期培養(yǎng)起始細胞(LTC-IC),、CFU-GEMM,、BFU-E、CFU-GM回收率為82%～91%［4］,。Broxemeyer等［5］研究表明凍存10年的臍血HSC仍具有良好的回收率,，這提示建臍血庫的可能性。 正常狀態(tài)下,，外周血中的干/祖細胞含量占MNC的0.01%～0.1%,，相當于骨髓的1%～10%，動員出的外周血MNC中CD34＋細胞數(shù)及CFU-GM數(shù)均明顯高于骨髓,。以上研究提示臍血,、外周血干細胞(PBSC)是骨髓移植的良好替代物。
3 PBSC動員和采集 PBSC動員的方式有三種,，即大劑量化療,、單用造血生長因子(HGF)和二者合用，異體供者單用HGF動員,，腫瘤患者則采用大劑量化療和(或)HGF,。HGF較常用的是G-CSF或GM-CSF，G-CSF效果優(yōu)于GM-CSF,，后者副作用明顯多于前者,；Hoglund等［6］研究發(fā)現(xiàn)糖基化的G-CSF動員CD34＋細胞峰值數(shù)明顯高于非糖基化的G-CSF。大劑量化療多采用環(huán)磷酰胺(CTX)4～7g/m２靜滴,，可使外周血CFU-GM提高50倍以上，化療與HGF合用可使CFU-GM提高百倍以上,，最高可達1000倍左右,。臨床及實驗研究發(fā)現(xiàn)，IL-1,、IL-3,、IL-6、IL-11,、Epo,、SCF、PIXY321,、MIP-1α雖也有動員作用,，但單用效果不佳，一般兩個或兩個以上HGF聯(lián)合或與化療聯(lián)用效果較好,；IL-8動員作用尤其快速,；最具有吸引的是Flt3配體可能具有良好的動員作用，有研究表明單用Flt3配體9天即可使鼠外周血CFU-GM增加83倍,，與G-CSF合用增加2?193倍,，用鼠PBSC移植后能長期穩(wěn)定造血［7］。有關外周血干細胞動員的機制尚不清楚,，可能與化療及細胞因子對骨髓微環(huán)境和HSC生物學功能(粘附能力,、通透性)的改變有關。PBSC的采集采用CS 3?000或Cobe Spectra分離MNC,，前者啟動后形成穩(wěn)定白細胞層所需時間明顯較短,，而收集CD34＋細胞及MNC的效率明顯高于后者［8］。
4 HSC的純化與保存 可用活化細胞分選術,、免疫磁珠,、免疫親和柱等方法富集CD34＋HLA-DR-、CD34＋CD33- HLA-DR-,、CD34＋CD38-Lin-,、CD34＋Thy＋Lin-等早期干/祖細胞。干細胞純化具有凈化自體移植物,、提高干細胞體外擴增及基因轉導的效率,、減少異體移植(尤其是2～3個位點不合的異體移植)GVHD及移植排斥的發(fā)生等作用，對于難治性自身免疫性疾病可經(jīng)干細胞純化除去異常免疫細胞后行自體移植,。
HSC可以采用程控降溫 (-196℃液氮保存) 及 -80℃長期保存,，兩種方法均有良好的回收率，尤其是 -80℃保存簡單易行適合于我國基層單位,。4℃保存HSC只適合于72小時內(nèi)移植用,。
5 造血干細胞移植的臨床應用 造血干細胞移植已廣泛用于許多難治性疾病，特別是白血病,、腫瘤,、遺傳性血液病、再生障礙性貧血及難治性免疫性疾病的治療,，取得了顯著的效果,。到1997年5月，國際上已有五萬多患者成功地進行了骨髓干細胞移植,，其中二萬多人已生存5年以上,。全世界共有450萬人登記志愿獻骨髓,，其中170萬人已作了HLA配型。但是患者能找到HLA匹配的同胞供者的可能只有30%,，而尋找無關供者費時費錢,，故異體移植只能使部分患者受益［3］。自體移植,、UCBT因療效確切,，HSC來源廣泛而倍受推崇，歐洲1995年自體移植病例數(shù)占該地區(qū)全年所有的移植病例數(shù)的68%［9］,。
PBSC移植(T)已廣泛用于臨床,，自體(A)PBSCT病例數(shù)已超過自體骨髓移植(ABMT)，歐洲1995年自體移植的患者中79%為APBSCT［9］,。它具有造血恢復快,， 術后并發(fā)癥少等優(yōu)點，治療白血病3年無病生存率(DFS)及復發(fā)率(RI)與ABMT相當,，適合于實體瘤的治療［8］,。異體PBSCT近年也發(fā)展較快，以往人們擔心異體PBSCT所輸入的PBSC中含有大量淋巴細胞會引起嚴重GVHD,，但實踐證明,，急性GVHD發(fā)生率不比異體BMT高，但慢性GVHD發(fā)生率則高于異體BMT［10］,。
6 腫瘤細胞的凈化 ABMT與APBSCT主要存在的問題是復發(fā)率高,，移植物中污染的腫瘤細胞是其原因之一，因此,，有必要對移植物體外凈化,。體外凈化移植物的方法較多，主要有物理學,、化學,、生物學、免疫學等方法,。有關腫瘤凈化方面的文章很多,，各種凈化方法體外實驗均發(fā)現(xiàn)有一定效果，但對其臨床效果一直存在爭論,，其主要原因是缺乏隨機對照的臨床試驗加以驗證,，缺乏有效而可靠的評估凈化效果的檢測手段。環(huán)磷酰胺衍生物Asta-Z,、4-HC,、mafosfamide等是公認有效的凈化藥,。Laporate等總結1983～1993年10年間125例Asta-Z凈化后ABMT的AL患者,，84例AML 8年長期生存率(LFS)及RI分別為58%和25%；41例ALL的8年LFS及RI分別為(CR1)56%和37%、(CR2)34%和48%,。用單克隆抗體進行免疫凈化,，主要有兩種形式，其一是用針對白血病免疫表型的單抗與相應的抗原結合,，借助補體依賴的細胞毒作用,、免疫磁珠或免疫毒素等二步效應機制達到凈化目的，一般可達到3～6個對數(shù)級的殺傷效果,；另一種方法是CD34＋細胞選擇,，經(jīng)一次純化后CD34＋細胞的純度可達60%，并可使腫瘤細胞減少約3個對數(shù)級,，多次純化后CD34＋細胞的純度可達99%,，但反復純化后將會丟失大量干/祖細胞，因此,，進行1～2次純化較合適,，這適合于乳腺癌、淋巴瘤,、多發(fā)性骨髓瘤(MM)等瘤細胞不表達CD34的疾病,。此外，可利用白血病祖細胞表達CD38,，而早期階段正常HSC不表達CD38的特點,，陽性選擇CD34＋CD38-的細胞或先純化CD34＋細胞，再用白血病細胞特異性抗體借助補體造成對白血病細胞殺傷,，達到凈化的目的,。Schiller等對55例MM患者采用CD34＋細胞陽性選擇后行APBSCT，采用PCR檢測動員后分離的白細胞及凈化后的移植物中患者特異性的免疫球蛋白基因的表達,，結果發(fā)現(xiàn)移植物中殘留瘤細胞可降低2.7～4.5個對數(shù)級,，但3年無進展生存率為29%，與未凈化者沒有差別,。陽性選擇Ph陰性干細胞用于CML患者及大劑量化療后選擇CD34＋細胞用于MDS患者自體移植也在研究中,。有關CD34＋細胞純化的凈化意義有待進一步評價。
采用反義技術,，針對bcr/abl,、PML-RARα、 c-myb,、c-myc等癌基因設計反義寡核苷酸序列,，使與靶基因結合，終止癌基因表達,。體外實驗研究發(fā)現(xiàn)對bcr/abl斷裂點行反義寡核苷酸凈化,，明顯抑制CML細胞克隆生長,，但臨床療效尚不肯定。
7 臍血干細胞移植特點 自1988年Gluckman等首次對1例5歲范可尼貧血男孩進行了UCBT獲成功以來,，已有2?000多人進行了UCBT,，成為異體BMT的一種有效替代手段［3］。UCBT具有臍血來源豐富易于采集與凍存,，移植后能夠長期穩(wěn)定重建造血,，但造血恢復慢，GVHD發(fā)生率低等特點［3,，11］,。目前UCBT主要限于兒童，盡管有84kg重成人UCBT成功的報道,，但成人UCBT例數(shù)尚少,。臍血HSC數(shù)對于獲得長期植入是一個關鍵因素，因此成人UCBT還有待干細胞體外擴增技術的發(fā)展,。
8 HSC體外擴增 一般常用的擴增體系是無血清懸浮培養(yǎng),、依賴基質(zhì)細胞的培養(yǎng)，在兩種體系中加用不同的細胞因子,，但一般都是對祖細胞的擴增,，LTC-IC變化不是十分顯著，如在無血清懸浮培養(yǎng)體系中培養(yǎng)8天,，細胞數(shù)擴增30倍,，至14天時擴增1?000倍以上，而造血祖細胞則擴增190倍,，同時CD34＋CD38-,、CD34＋HLA-DR-、CD34+Lin-以及耐Asta-Z的CD34＋細胞絕對數(shù)也增加3～9倍,，而LTC-IC絕對數(shù)維持原水平,。在含有基質(zhì)細胞的培養(yǎng)體系中加入SCF、IL-3,、GM-CSF,、Epo,細胞數(shù)擴增21倍，而LTC-IC則增加7.5倍,。Kalle等［12］總結以往不同細胞因子組合對HSC體外擴增效果,，發(fā)現(xiàn)除個別研究者報告LTC-IC可擴增100多倍外，多數(shù)研究者報告LTC-IC在體外只可維持原來數(shù)目或擴增數(shù)倍至數(shù)十倍不等,。但令人興奮的是最近意大利學者Piacibello等［13］研究發(fā)現(xiàn)在含有Flt3配體及血小板生成素(Tpo)兩種生長因子的無基質(zhì)細胞培養(yǎng)體系中,，臍血CD34＋細胞可培養(yǎng)6個月以上，開始培養(yǎng)5周后CD34＋細胞擴增1?600倍,，20周時達146?000倍,，6個月時CFU-GM達200萬倍,，尤其是20周時LTC-IC超過20萬倍。這一培養(yǎng)體系不僅促進祖細胞的增殖分化,，同時促進早期干細胞的擴增，為UCBT用于成人提供了良好的前景,。干細胞擴增應用于臨床還處于初期階段,，臨床已證實使用安全，可以促進早期造血植入,。干細胞體外擴增還有待于方法學的改進,，達到對多能造血干細胞及早期祖細胞的擴增。將來研究擴增CD34＋細胞產(chǎn)生大量活化樹突狀細胞用于免疫治療,、擴增臍血干細胞用于成人UCBT,、尤其是用于基因治療等將令人矚目。
9 HSC改造 HSC由于具有自我更新,、體外擴增及分化為各系造血細胞的能力,，來源豐富且易于體外處理及重建持久造血，HSC及其子代能通過血液循環(huán)與全身各器官系統(tǒng)相互作用等優(yōu)點,，由此決定了HSC,，尤其是純化后的HSC是基因治療的良好靶細胞。盡管已進行了250多項轉基因試驗,，除腺苷脫氨酶(ADA)缺陷患者外,，很少有患者直接受益于這種治療［5，14］,。阻礙HSC基因治療進展的主要原因是目前所使用的載體如逆轉錄病毒不能將目的基因轉入非分裂期細胞,、轉導效率低等。研究新的載體系統(tǒng)如HIV載體,、腺病毒載體,，進一步了解HSC的生物學特性等可能會促進基因治療的發(fā)展。
10 HSC處理過程中的質(zhì)控 為保障患者得到安全有效的治療,，必須加強HSC處理過程中的質(zhì)量控制,，各項操作程序規(guī)范化，嚴格掌握適應證與禁忌證,。世界上不少國家都制定了相應的法規(guī),，以保證造血干細胞采集、處理及保存過程中的質(zhì)量,。在這些過程中發(fā)生病原微生物污染是不容忽視的問題,。PBSCT所需CD34＋細胞數(shù)，國外最低標準為2×10６/kg,，但各國之間,，各實驗室之間CD34＋細胞檢測時可變因素較多,，差異較大，因此應規(guī)范操作步驟,，保持試劑的穩(wěn)定性,；動員后PBSC峰值時間只有1～2天，應很好地把握,；正常供者用G-CSF動員PBSC,，盡管已證實對供者早期無影響，但是遠期影響還有待觀察,，動員過程中當WBC≥70×10９/L時應減少G-CSF用量,，供體有炎癥、自身免疫性疾病或風濕病,、動脈粥樣硬化或腦血管病變是動員PBSC的禁忌證,；UCBT尚處于初期階段，所需最低有核細胞數(shù),、CD34＋細胞數(shù),、CFU-GM數(shù)還有待于研究，建立臍血庫過程中,，必須由經(jīng)過培訓的專業(yè)人員在高清潔度的場所嚴格無菌消毒后采集臍血,，嚴格掌握采集適應證與禁忌證，采集的臍血必須在24小時內(nèi)處理,，包括對臍血進行HSC質(zhì)量,、血型、HLA-Ⅰ與HLA-Ⅱ類抗原,、細菌與霉菌檢測,，對臍血及母體血進行乙肝、抗HIV-Ⅰ,、抗HIV-Ⅱ,、抗-HCV、抗-CMV檢測,，然后冷凍保存,，胎兒出生后必須觀察3～6個月，確無失天性及遺傳性疾病其臍血方可用于UCBT?［15］,。
作者單位：300020 天津,，中國醫(yī)學科學院、中國協(xié)和醫(yī)科大學血液學研究所血液病醫(yī)院
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