劉明 譯
大連理工大學(xué)
本文通過研究小鼠感染模型中特定的結(jié)核分支桿菌mycobacterium tuberculosis突變體,，發(fā)現(xiàn)了減毒attenuated的突變體,它們分別歸屬于幾類表型,，這些突變體因?yàn)閰^(qū)別于野生型的結(jié)核分支桿菌的生長特征而歸為幾類，包括嚴(yán)格地寄存于活體內(nèi)的突變體，能寄存于活體內(nèi)的突變體，耐受型突變體，變態(tài)型突變體和傳播型突變體,。這里對每一類型的突變體分別舉例并加以描述同時(shí)相應(yīng)地加以劃分，確定了分枝桿菌中分別與體內(nèi)生長,，離體存活力和免疫病理學(xué)誘導(dǎo)相關(guān)基因產(chǎn)物的重要性,，這必將更好地理解寄主－病原體的相互作用以及潛在的用于新的抗結(jié)核桿菌的處理方案。
目前,，結(jié)核桿菌仍舊是主要的致死病原微生物,，世界人口大約有32％ 的人群受到了感染。世界衛(wèi)生組織于1993年宣布結(jié)核桿菌感染為全球緊急危機(jī)事件,，（因感染結(jié)核桿菌）每年大約導(dǎo)致1,800萬人死亡,也就是說每天死亡4,931人（這相當(dāng)于10架滿載的波音747客機(jī)失事的死亡人數(shù)）,。結(jié)核桿菌具有的多重抗藥性和致病成分以及免疫缺陷病毒感染后的人群對結(jié)核桿菌的易感性是這種疾病能夠廣泛傳播的原因。結(jié)核桿菌是由Koch分離的,，他還論證了結(jié)核桿菌與疾病之間的關(guān)系,。利用結(jié)核桿菌基因組全序列以及基因轉(zhuǎn)移與基因破裂這些技術(shù)優(yōu)越性最終使人們發(fā)現(xiàn)了這種復(fù)雜的人類病原體的幾種生存策略。
抗結(jié)核桿菌免疫性
結(jié)核桿菌感染的主要途徑是呼吸系統(tǒng),，細(xì)菌以空氣飛沫的形式被吸入,，并最終進(jìn)入到肺部造成感染。進(jìn)入肺部后,，結(jié)核桿菌首先遇到的細(xì)胞類型就是肺泡巨噬細(xì)胞,，這種細(xì)胞能夠消滅大多數(shù)潛在的入侵者。但是,，結(jié)核桿菌對其具有超常的抵抗能力,，甚至能夠在這種極其惡劣的環(huán)境中復(fù)制，而這種環(huán)境對于其他大多數(shù)病原體則意味著死亡,。
結(jié)核桿菌的免疫力主要依賴于細(xì)胞介導(dǎo)的免疫而非體液免疫,。這種免疫特異性在細(xì)胞免疫力降低的患者中,，例如感染了免疫缺陷病毒的患者或者正進(jìn)行免疫抑制治療的患者中比缺乏體液免疫的患者,，比如患多重骨髓瘤的患者中，具有相對增高的結(jié)核桿菌感染的危險(xiǎn)性來加以闡明的。巨噬細(xì)胞在結(jié)核桿菌(的感染過程中)具有多重功能,，包括抗原形成過程和抗原傳播過程,，以及進(jìn)入更深層組織中的運(yùn)輸過程，并且因此而將感染傳播到深層去以及細(xì)胞效應(yīng)子的傳播過程中,。但是至少在小鼠的感染過程中,，結(jié)核桿菌有能力突破先天免疫的圍剿，作為致病力極強(qiáng)的結(jié)核桿菌在感染小鼠肺部最初的幾周,，以指數(shù)級進(jìn)行復(fù)制,。然而，在應(yīng)答免疫啟動(dòng)后,，結(jié)核桿菌以穩(wěn)態(tài)水平生長(見圖1),。保護(hù)性的應(yīng)答免疫是以CD4＋ 和CD8＋ T細(xì)胞和T細(xì)胞助手類型一細(xì)胞因子的剖面為主，而關(guān)鍵的細(xì)胞因子T細(xì)胞助手類型一：干擾素－γ（IFN－γ）和白細(xì)胞介素12的重要性,，是通過缺乏白介素12以及它的受體和干擾素IFN－γ的受體的個(gè)體對結(jié)核桿菌的易感性的事實(shí)來得到證明的,。
結(jié)核桿菌能夠在細(xì)胞內(nèi)存活并復(fù)制，而這種環(huán)境對于大多數(shù)的入侵者而言意味著滅亡（圖2）,，人們普遍接受的觀點(diǎn)是結(jié)核桿菌主要的生境是宿主巨噬細(xì)胞并且結(jié)核桿菌似乎已經(jīng)進(jìn)化了能夠在巨噬細(xì)胞的效應(yīng)分子起作用的情況下有效的存活機(jī)制,。這些有效的防御機(jī)制包括抑制吞噬體－溶酶體融合。人們發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌延遲了巨噬細(xì)胞的成熟進(jìn)程,，并利用補(bǔ)體1和3用于細(xì)胞的進(jìn)出,，而這樣卻沒有觸發(fā)氧化的爆發(fā)。然而,，結(jié)核桿菌能夠通過多種受體進(jìn)入巨噬細(xì)胞卻不影響它的生存,。其他的效應(yīng)分子機(jī)制包括過氧化氫酶和能夠降解活性氧中間物的超氧化物歧化酶，還有報(bào)道,，結(jié)核桿菌向下調(diào)節(jié)一些宿主免疫調(diào)節(jié)物例如白細(xì)胞介素12,，主要的組織兼容性復(fù)合物MHCⅡ族， IFN－γ介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活動(dòng),，IFN－γ誘導(dǎo)基因gamma1和宿主的細(xì)胞凋亡,。
體內(nèi)生長突變體的分類
研究感染小鼠模型中明確構(gòu)建的的結(jié)核分支桿菌突變體，發(fā)現(xiàn)了減毒的突變體,他們分別歸屬于幾類表型,，這些突變體因?yàn)閰^(qū)別于野生型的分枝桿菌屬結(jié)核菌的生長特征而歸為幾類,，包括嚴(yán)格地寄存于活體內(nèi)的突變體(sgiv)，它們在克隆形式時(shí)隨著時(shí)間的推移會(huì)顯著地減少,；能寄存于活體內(nèi)的突變體(giv),，它們雖不像野生型那樣在免疫低下的小鼠中狂野地生長，但仍然比sgiv生長得好;持久存活型突變體(per),，它不能夠在免疫應(yīng)答啟動(dòng)后生長或者存活;變態(tài)型突變體(pat),它們具有和野生型一樣的生長特征,，但是具有改變的病理,。(圖3)
結(jié)核桿菌的減毒突變體都是令人感興趣的潛在的疫苗的選擇對象，如上所述,，具有不同的特征的族,，提供了疫苗開發(fā)不同的途徑，目前急需新的疫苗,，目前的疫苗,，卡介苗calmette guerin (m.bovis BCG)，在效率上很不相同,，印度報(bào)道的效率為0％,。盡管監(jiān)控了超過三百萬人，目前的疫苗不能減少疾病的蔓延,。另外,，它將會(huì)具有益處，比BCG具有的是封阻內(nèi)感染的能力,，而BCG主要防止結(jié)核桿菌的非控制復(fù)制和以及從最初的感染的位點(diǎn)到肺的其余部分以及身體其他部分的傳播,。提高BCG作為疫苗載體的一個(gè)途徑是加強(qiáng)抗原或加強(qiáng)它的免疫原性的功能。例如,，BCG導(dǎo)致CD8-T細(xì)胞的能力是通過加強(qiáng)來自listeria monocytogene的listeriolysin分泌能力,。BCG的免疫原性也通過關(guān)鍵抗原的過表達(dá)或者增加BCG ，RD1,，以及后面的BCG刪除后的原始減毒區(qū)域 ,。
新的結(jié)核桿菌疫苗開發(fā)的主要目的是直接來自人體中的結(jié)核桿菌致病成分而非來自牛結(jié)核桿菌的卡介苗。結(jié)核桿菌分子生物學(xué)的最新進(jìn)展導(dǎo)致了幾種減毒突變體作為疫苗的侯選者,。生產(chǎn)人結(jié)核桿菌來源的疫苗的目的是要比牛結(jié)核桿菌來源的卡介苗要更有效,，質(zhì)量上更佳的保護(hù)性的免疫應(yīng)答?？ń槊绲谋Ｗo(hù)作用的降低主要原因是BCG的免疫原性的降低,。因此，結(jié)核桿菌的突變體應(yīng)該具有更好的保護(hù)作用主要是抗原部分結(jié)構(gòu)的表達(dá)而這部分與毒性的結(jié)核桿菌有很高的同源性,。對這些突變體各族的分析鑒定也能夠提供結(jié)核桿菌與宿主之間相互作用的新認(rèn)識,。這些知識也有助于確定這種細(xì)胞內(nèi)病原體用于高度成功地在宿主內(nèi)打破惡劣環(huán)境的策略。
嚴(yán)格生長的突變體sgiv
最初,， sgv突變體,被人們認(rèn)為是一種理想的疫苗候選者,，因?yàn)樗痪邆潴w內(nèi)復(fù)制和存活的能力從而具有了高度的毒性降低，因此尤其是對于部分免疫低下的個(gè)體,可能具有比卡介苗更高的安全性,。但是作為抗結(jié)核的疫苗而言,復(fù)制能力與持久性是更受歡迎的特征,，因?yàn)檫@樣它可以允許一個(gè)延長的免疫反應(yīng)，這與獲得減毒卡介苗疫苗的作用是相似的,。大多數(shù)sgv突變體產(chǎn)生相對減少的病理是因?yàn)樗鼈儼l(fā)生了嚴(yán)格的生長缺失,。許多突變體是因?yàn)槿笔Я双@得用于在宿主吞噬體的惡劣環(huán)境(結(jié)核桿菌卻能夠在此復(fù)制)中進(jìn)行成功的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制所必需的營養(yǎng)的能力,。例如，獲得鎂,，對于在吞噬小體中生活的結(jié)核桿菌和其他的細(xì)胞內(nèi)病原體，沙門氏菌（salmonella enterica）的毒性是必須的,。因此,，在mgt方面的突變，這種參與了鎂的運(yùn)輸?shù)耐蛔?，?dǎo)致了代表了含有吞噬小體的結(jié)核桿菌情況下由于低濃度鎂和適度酸性pH值,體內(nèi)復(fù)制的減少,。這些結(jié)核桿菌突變體在小鼠的肺部和脾部顯示了充分的生長減少，這是 sgv的突變的特征,。
許多結(jié)核桿菌的營養(yǎng)缺陷型的突變體也顯示sgiv表型特征,。事實(shí)上，亮氨酸.賴氨酸leuD. 杏仁糖proC, 色氨酸t(yī)rpD和嘌呤營養(yǎng)缺陷型的結(jié)核桿菌不能在鼠肺中生長,。對于使用sgv營養(yǎng)突變表型作為疫苗候選者的潛在的用途,，在注射給藥的鼠中，proC和trpD提供了與卡介苗相似的保護(hù)作用,，然而,，嘌呤營養(yǎng)缺陷型提供了與噴霧感染豬模型中的卡介苗相似的保護(hù)作用。這些數(shù)據(jù)中揭示了sgiv表型突變體作為潛在的候選者用于改進(jìn)的疫苗和有理由進(jìn)一步去加以研究,。
體內(nèi)生長的突變體giv
大部分構(gòu)建的突變體都被劃分入體內(nèi)生長的突變體型,顯示了降低的生長和病理,，導(dǎo)致了減毒的表型和并與宿主存活時(shí)間相關(guān)聯(lián)。這些突變體可以成為理想的疫苗后備物,，因?yàn)樗麄儽３謴?fù)制并更可能導(dǎo)致比sgiv突變體更為長期的宿主免疫反應(yīng),。但是，如果突變體仍保持它的生長速率,，這可能發(fā)生在免疫低下的個(gè)體中,，那么潛在的危險(xiǎn)形勢也就增高。這必將導(dǎo)致發(fā)生疾病,。因此,，特異突變體持續(xù)性的特征要求開發(fā)的菌種能夠引起強(qiáng)烈的免疫保護(hù)反應(yīng)，但是在免疫缺陷的個(gè)體中,，又不能激活這種免疫反應(yīng),。
舉一個(gè)例子是giv顯型，它是刪除了在卡介苗和結(jié)核桿菌中編碼輸出重復(fù)蛋白（erp）基因產(chǎn)生的,。還沒有確定其功能,，這個(gè)基因?qū)τ诮Y(jié)核桿菌菌種具有特異性，這個(gè)基因的刪除,，與菌體在BALB/c鼠中的肺部與脾中的生長和在巨噬細(xì)胞中的生長相匹配,。因此,，Berthet 等提出毒性是依賴于菌體的繁殖的能力的。結(jié)核桿菌giv突變體的另一個(gè)例子是谷氨酸合成酶基因突變體glnA1,。這個(gè)基因的產(chǎn)物在氮代謝中很重要,。并且glnA1突變體無論是在體內(nèi)巨噬細(xì)胞中生長還是在幾內(nèi)亞豬感染模型的存活研究中都是減毒的。細(xì)胞內(nèi)結(jié)核桿菌的含鐵物質(zhì)的獲得被認(rèn)為是由分支桿菌生長素（含2－羥基苯胂酸的含鐵細(xì)胞分子）介導(dǎo)的,，和一個(gè)mbtB刪除突變體只能在鐵離子限制培養(yǎng)基而非鐵富余培養(yǎng)基生長,，并在人類單核細(xì)胞來源的細(xì)胞株系THP-1中顯示減弱的生長。單獨(dú)地,，從這些實(shí)驗(yàn)來看,，似乎結(jié)核分支桿菌已經(jīng)進(jìn)化出一套多樣的方式去合成或者汲取必要的養(yǎng)分用于在菌體居住的營養(yǎng)受限制的吞噬小體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。
一種鑒定病毒相關(guān)基因的手段是信號標(biāo)簽突變技術(shù),，這是一種用于鑒定決定病原體在動(dòng)物模型中生長的基因有力的篩選方法,。這種方法已經(jīng)用于人類的許多病原體，包括結(jié)核桿菌,。有這樣兩項(xiàng)研究,，一是,獲得突變體是屬于giv類型(在鼠肺中生長缺陷)中，這也強(qiáng)調(diào)了明顯的結(jié)核分支桿菌的細(xì)胞壁脂質(zhì)的重要性,。Camacho和他的同事們鑒定了16個(gè)減毒突變體,，大部分都參與了脂質(zhì)的代謝或者跨膜運(yùn)輸。有幾個(gè)突變體是打破了參與復(fù)合細(xì)胞壁脂質(zhì)成分pthiocerol和phenolpthiocerol來源物合成的成簇基因,，這些成分只在為病原體品種的結(jié)核桿菌中發(fā)現(xiàn),。相似的，Cox等人的研究,，破壞了pthiocerol dimycocerosate 合成和運(yùn)輸,，所有的突變體顯示了克隆形態(tài)學(xué)的變化，是折疊的管狀結(jié)構(gòu)而不是野生克隆的平的束狀結(jié)構(gòu),，相應(yīng)的,，細(xì)胞壁也發(fā)生改變。
為了感受與適應(yīng)面臨的宿主免疫反應(yīng)的各種階段的變化的環(huán)境,，系統(tǒng),，例如在結(jié)核桿菌中的兩種相容調(diào)節(jié)的蛋白phoP 和 phoQ,被認(rèn)為是對細(xì)胞內(nèi)存活起重要作用。在許多人類重要的病原體包括 salmonella sp,shigella sp,yersinia sp和結(jié)核桿菌,兩個(gè)成分調(diào)節(jié)蛋白控制著存活中起重要作用的轉(zhuǎn)錄基因,。事實(shí)上,，結(jié)核桿菌phoP突變體在感染的鼠模型中生長是減少的。在肝,，肺,，和脾中生長是減少的，而這是giv的特征,。并且在體外培養(yǎng)的骨髓來源的巨噬細(xì)胞中結(jié)核桿菌細(xì)胞復(fù)制是減少的,。phoP突變體不同于野生型的就在于相對富余的ManLAMs和monoacylated ManLAMs. ManLAMs是在病原體緩慢生長的結(jié)核桿菌種類中發(fā)現(xiàn)的,。人們認(rèn)為它是一種關(guān)鍵的毒因子和強(qiáng)有力的抗炎癥介子。這可能解釋了phoP突變體的giv表型,，雖然,，這種特殊的機(jī)制人們?nèi)栽诜治鲋小?/p>
因?yàn)榇蠖鄶?shù)菌體毒因子被運(yùn)出，人們猜想也可能結(jié)核桿菌使用的是人們?nèi)晕戳私獾亩疽蜃臃置谙到y(tǒng),。對附屬的分泌因子secA2的刪除,，結(jié)果是這種突變體在小鼠中的毒性減弱，這再一次顯示了giv表型的特征,。這一觀察揭示了結(jié)核桿菌能夠分泌免疫介子，它們能夠抑制宿主內(nèi)的先天免疫反應(yīng),。正如以前提到的,，結(jié)核桿菌能夠部分克服巨嗜細(xì)胞效應(yīng)因子機(jī)制產(chǎn)生的強(qiáng)烈的毒性,這是活性氧介質(zhì)的產(chǎn)物,是通過SOD起作用的。超氧化物歧化酶缺乏蛋白運(yùn)輸?shù)牡湫托盘栃蛄?，然而,，它的分泌是secA2依賴的。另外還發(fā)現(xiàn)了許多免疫介質(zhì),是這個(gè)以前未發(fā)現(xiàn)的途徑分泌的,。
Pantothenate(維他命B5)生物從頭合成的重要性,，通過刪除其合成基因panC和panD也被證明了。在存活的研究中,panCD雙刪除突變體是高度減毒的,。并且在免疫低下的SCID鼠中比卡介苗更安全,。panCD表型突變在免疫活性鼠中仍舊保持有限的復(fù)制的能力，并進(jìn)而在經(jīng)歷了噴沫感染結(jié)核桿菌后對鼠有實(shí)質(zhì)性的保護(hù)作用,。
持久存活型突變體(per)
結(jié)核桿菌極其成功的存活于人類宿主中,，而此處通常人們認(rèn)為在肺部肉牙瘤中是保持著有"墻壁"的存活，雖然最近的研究已經(jīng)揭示這種菌也可以在非"專業(yè)"的吞噬小體中存活,。實(shí)際上,，大多數(shù)人感染了這種菌后沒有明顯的癥狀。并且,，只有當(dāng)他們的免疫系統(tǒng)被擾亂后--例如,，AIDS發(fā)作后，衰老,，酗酒過度后等才發(fā)展成明確的疾病,。這種無癥狀的感染被稱為潛伏疾病，是眾所周知的難以對付的疾病,，主要是因?yàn)檫@種菌是處于休眠的,，而大多數(shù)抗生素直接對抗的是復(fù)制狀態(tài)的菌。事實(shí)上,，目前的處理活躍的結(jié)核桿菌的程序是使用6個(gè)月"前線"藥物,，去處理已達(dá)到難于存活的液體郁積（在這種狀態(tài),，沒有菌體可以體外培養(yǎng)）。但是,，處于休眠的菌體可以被體外培養(yǎng),。因此，疾病仍可能被激活,。事實(shí)上,，在鼠的休眠感染模型（CORNELL模型）中，總的免疫抑制處理無法培養(yǎng)材料的郁積液體仍可能激活結(jié)核桿菌的感染,。
為了對抗宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng),，結(jié)核桿菌可以采用了它的持久存活性特征。因此人們期望突變體缺乏這種面對免疫攻擊時(shí)的持久性（這就是,，per突變體）,。這類突變體特征的鑒定可能會(huì)導(dǎo)致闡明在這個(gè)階段結(jié)核桿菌用于生存和持久存活的機(jī)制。
Koch首先描述了結(jié)核桿菌毒性與具有克隆形態(tài)為"cording"的關(guān)系,；也就是說,，由菌體產(chǎn)生的編織狀的微生態(tài)泡的形成。結(jié)核桿菌的卡介苗不能形成cord的突變體的遺傳學(xué)篩選導(dǎo)致了鑒定出一組不能耐受的突變體,。這些突變體是破壞了編碼的αmycolates真菌(pcaA)的接近中心的環(huán)丙烷的基因,，在感染的起始階段正常的復(fù)制，因此確定了環(huán)丙烷化的脂質(zhì)在結(jié)核桿菌免疫原性中的功能,。同樣的,，在pcaA突變體中也發(fā)現(xiàn)了這一點(diǎn)，結(jié)核桿菌pcaA突變體感染的小鼠肺中的特征是聚合了大量的淋巴細(xì)胞,，這揭示了枝霉菌的脂質(zhì)環(huán)丙烷化可能在減少宿主獲得性免疫反應(yīng)時(shí)必需的淋巴細(xì)胞流中起很重要的作用,。 其他的per突變體，有在編碼異檸檬酸(裂合)酶icl的基因發(fā)生突變,，這個(gè)酶對與脂肪酸的代謝是必需的,，有編碼磷脂酶C(plc)的基因突變，它是負(fù)責(zé)切割磷脂酰膽堿基因的,，和大多數(shù)毒性結(jié)核桿菌品種相關(guān)聯(lián)的,；而relMET突變體，這是與維持長期的存活力相妥協(xié)的 ,。icl突變體菌在小鼠中,，在感染的急性期顯示了正常的生長，但是在獲得性免疫啟動(dòng)后確實(shí)很少的生長,，這揭示了持久性存活是部分的依賴于脂肪酸的代謝,。
結(jié)核桿菌有四個(gè)公認(rèn)的磷脂酶，plcA，plcB,，plcC和plcD,。已經(jīng)構(gòu)建單獨(dú)或者多個(gè)基因的刪除突變體。所有這些突變體顯示了磷脂酶plcC的升高,，這說明每個(gè)基因都對酶活力的改變有同等的作用,。三聯(lián)突變體plcABC 和四聯(lián)體 plcABCD顯示了典型的per表型，它們在感染的晚期是減毒的,。這就揭示了磷脂酶C活力具有一個(gè)仍舊未鑒定的功能是使結(jié)核桿菌能夠在宿主T細(xì)胞的介導(dǎo)的免疫攻勢下存活,。
在營養(yǎng)被剝奪后，所有的菌開始更緩慢的生長并且"限制性反應(yīng)"也增長了,。這種"限制性反應(yīng)"是以蛋白合成的數(shù)目以及rRNA 和tRNA的合成數(shù)目減少為特征的,。在結(jié)核桿菌中，"限制性反應(yīng)"是由 超磷酸化鳥嘌呤核苷酸 或者(p)ppGpp介導(dǎo)的, (p)ppGpp 是由結(jié)核桿菌 RelMtb酶合成并水解的,。缺乏這種酶的突變體,，在體外也缺乏長期的存活性。在BLBA/c小鼠的肺和脾中這種突變體的表型是一種per突變體,，顯示了在獲得性免疫過程中的破損能力,。這揭示了"限制性反應(yīng)"是結(jié)核桿菌體內(nèi)耐受性生長必需的,。
結(jié)核桿菌也調(diào)節(jié)了壓力誘導(dǎo)的不利條件下的SOS反應(yīng),。這種反應(yīng)改變了遺傳突變率，作為產(chǎn)生突變體的手段從而比親本菌株更適合于生存,。而且,，Boshoff等人猜測在結(jié)核桿菌中主要的復(fù)制DNA聚合酶（DnaE2）可能參與了錯(cuò)誤傾向修補(bǔ)合成。事實(shí)上,，dnaE2在體外向上調(diào)節(jié)對破壞DNA事件例如紫外線和過氧化氫的反應(yīng),。經(jīng)過紫外線輻射處理后，在感染九個(gè)月后的鼠肺中發(fā)現(xiàn),，dnaE2突變體顯示了減少的生存和克隆數(shù)目,。在存活研究中發(fā)現(xiàn)了，毒性的減低,。在野生型和互補(bǔ)菌株比突變體中更高頻率的產(chǎn)生藥物抗性,，顯示了這種聚合酶的活動(dòng)對于體內(nèi)藥物抗性出現(xiàn)的作用。這個(gè)方面的詳細(xì)研究 建立了在承受感染的過程中,，DnaE2－介導(dǎo)的DNA修補(bǔ),。
結(jié)核桿菌中熱激蛋白的過表達(dá)在慢性感染過程中也導(dǎo)致可觀的對存活性的破壞性。在體外,，骨髓來源的巨噬細(xì)胞中或在小鼠的早期感染階段沒有明顯的生長差異,。但是在感染的對抗期突變體的存活和生長在承受感染的階段則充分的減少，并且在脾中與CD8＋分泌的IFN－γ的T細(xì)胞的數(shù)目升高相一致,。Hsp70的過量表達(dá)在感染的慢性期可能有利于宿主而不是病原體,。這樣,，Hsp70的表達(dá)的誘導(dǎo)在疾病的潛伏期可以提供一種增強(qiáng)宿主防御的手段。
變態(tài)突變體(pat)
無論是面對先天免疫還是獲得性免疫,，pat突變體都未顯示明顯的生長缺陷,，但是，他們引起典型的抗結(jié)核桿菌的免疫反應(yīng),。因此,，顯示了明顯不同的宿主病理。這組突變體的鑒定強(qiáng)調(diào)了在結(jié)核桿菌基因組中對應(yīng)于宿主升高的免疫病理學(xué)要求的這種基因的存在,。但是,，結(jié)核桿菌具有的這樣的病理升高的基因的事實(shí)可能與菌體的傳播相關(guān)聯(lián)。事實(shí)上,，為了使結(jié)核桿菌感染新的宿主,，菌體必須被咳嗽出空氣的環(huán)境中去，因此,，一定是細(xì)胞外的支持液滴的有效傳播的,。人們認(rèn)為菌體位于額外的肺部病理和損壞相聯(lián)系的液化壞死損害中心的細(xì)胞外。鑒定pat突變體也強(qiáng)調(diào)了單獨(dú)的克隆形成分析是不充分的,，總的來看,，當(dāng)鑒定體內(nèi)菌的突變體時(shí)，也應(yīng)當(dāng)進(jìn)行存活研究和病理學(xué)檢測,。
一個(gè)結(jié)核桿菌細(xì)胞質(zhì)外的功能sigma因子H基因（sigH）在感染的小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn),，具有減低毒性的作用。但是,，這個(gè)突變體顯示沒有體內(nèi)生長缺陷,。減毒表型與很小的很少的細(xì)菌感染對應(yīng)，而這種感染不像野生型感染的小鼠那樣發(fā)展得很快,。在免疫低下的SCID小鼠中毒性沒有明顯的差異,，揭示了T-細(xì)胞介導(dǎo)的免疫參與了這種表型突變。事實(shí)上,，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示在感染具有免疫活力的四周的小鼠中菌體突變體中補(bǔ)充的僅有T細(xì)胞10％CD4＋和CD8＋進(jìn)入肺中,，而且很少的細(xì)胞產(chǎn)生IFN－γ和腫瘤壞疽因子α。從這些結(jié)果來看,，似乎是,，由突變菌體引起的溫和的T細(xì)胞反應(yīng)足夠用于控制的，在野生型感染的過度地非凡的反應(yīng)是升高的組織病理和明顯的野生型感染小鼠早期死亡的原因,。
當(dāng)進(jìn)行減毒和毒性的遺傳互補(bǔ)分析一個(gè)基因,，rpoV（也就是sigA），它在減毒的菌種中恢復(fù)毒性時(shí)，鑒定了另一個(gè)sigma因子,。這個(gè)基因顯示了與來自別的菌體中主要的轉(zhuǎn)錄因子和sigma因子高度的同源性,。并且最近的進(jìn)一步的研究確定了它作用的人們猜想的轉(zhuǎn)錄因子，叫做whiB.一個(gè)結(jié)核桿菌的whiB刪除突變體與野生型在菌體負(fù)擔(dān)上看沒有明顯的差別,。但在免疫活性的小鼠中顯示了減毒表型,。這一點(diǎn)是從存活實(shí)驗(yàn)中觀察到的。在野生型感染的小鼠中觀察到病理改變比在突變體感染的小鼠中要嚴(yán)重的多,，揭示了RpoV-WhiB3介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄影響了宿主的免疫反應(yīng),。SigH和whiB3的PAT突變體缺少調(diào)節(jié)基因系的控制，這揭示了這些調(diào)節(jié)子是典型的結(jié)核桿菌免疫病理誘導(dǎo)的需要的,。
進(jìn)一步的闡明由不同的突變體產(chǎn)生的不同的病理學(xué),，是全面的定義宿主免疫反應(yīng)功能的要求。例如,，突變誘導(dǎo)免疫病理學(xué)是否包括了不同的亞型和一定比例的T細(xì)胞,，著名的是，sigH和Hsp70突變體,，或者別的細(xì)胞類型,？這些突變體誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)分子的產(chǎn)物或分泌是不同的嗎？分解這些相互作用將會(huì)使人們進(jìn)一步的理解有利與不利的免疫病理學(xué)反應(yīng)并且開發(fā)出在疾病活躍狀態(tài)時(shí)加速的宿主的免疫反應(yīng)的策略,。Pat突變體沒有明顯的病理學(xué)特征,但是,，在高水平的感染耐久性可能也是一個(gè)好的疫苗候選人，刺激發(fā)生免疫反應(yīng)但是卻不產(chǎn)生有害的病理或者疾病,。在免疫低下的個(gè)體中,，這樣的突變可能很少產(chǎn)生威脅,，因?yàn)樗荒軐?dǎo)致個(gè)體發(fā)生疾病并且也不能將之轉(zhuǎn)移到新的宿主中去,。 傳播型突變體(dis)
雖然這個(gè)分類系統(tǒng)對于遇到的各種突變體是一種有效的分類方式，但也是變化的,。一個(gè)例子就是hbhA突變體未顯示明顯的可控的靜脈內(nèi)的生長缺陷,。但當(dāng)可控的鼻內(nèi)的顯示了明顯的肺外部位擴(kuò)散缺陷。這個(gè)突變形成了一個(gè)新的突變類別,，傳播型突變體(dis),。不能擴(kuò)散的疫苗的開發(fā)，在免疫低下的個(gè)體中有特殊的應(yīng)用?，F(xiàn)在有許多的報(bào)道,，在接種了卡介苗的痘的兒童發(fā)生擴(kuò)散的BCG疾病，接下來有發(fā)展成為AIDS,。在是具有AIDS成人中也象兒童一樣的接受疫苗,。
結(jié)核桿菌在宿主中比巨噬細(xì)胞的之外的細(xì)胞類型更好持久性存活，包括齒槽上皮細(xì)胞，在這種細(xì)胞中結(jié)核桿菌能夠在體外存活并復(fù)制,。對于結(jié)核桿菌的hbhA的破壞影響在齒槽上皮細(xì)胞中的粘附,，入侵，和存活,，但在巨噬細(xì)胞中則不發(fā)生影響,。并且在BALB/c小鼠中減少肺外克隆，這揭示了對于結(jié)核桿菌而言齒槽上皮細(xì)胞層這段通路對于肺外感染傳播是必須的,。用肝磷脂結(jié)合的紅血球凝聚素結(jié)合因子抗體孵浴野生型結(jié)核桿菌,，可以抑制傳播。,，這一點(diǎn),，也確證了這一假說，也揭示了使用這種抗體進(jìn)行治療時(shí)的潛在用途,。但是,，Muller-Oritiz等人，也使用了結(jié)核桿菌的hbhA突變體進(jìn)行研究,，報(bào)導(dǎo)了在更具有抗性的小鼠種類,，C57BL/6的肺部，肝,，脾中更全面的生長缺陷,。這種觀察上的不同可能與研究者使用的不同的小鼠品種有關(guān)。無論怎樣,，C57BL/6小鼠中的生長缺陷在肝部和脾部比在肺部的生長缺陷更明顯這可能是生長以及傳播缺陷的結(jié)果,。進(jìn)一步的分析HBHA和其他的細(xì)菌因子在傳播方面的功能是在這個(gè)疾病的關(guān)鍵時(shí)期的宿主－病原體相互作用更好的理解的需要。
結(jié)論
結(jié)核桿菌的細(xì)胞內(nèi)生活模式的知識將促進(jìn)對宿主-病原體相互作用和結(jié)核桿菌的進(jìn)一步侵入后先天應(yīng)答和獲得性免疫反應(yīng)機(jī)制的更深的理解,。這樣的知識必將導(dǎo)致新的,、 安全的 和有效的疫苗和抗結(jié)核桿菌的處理策略。
對于一個(gè)來源自活的結(jié)核桿菌的疫苗,，整體的要求就是在人體中和卡介苗具有一樣安全性或更安全,。sgiv突變體不能在體內(nèi)生長，例如,，亮氨酸.脯氨酸.色氨酸. 嘌呤缺陷型顯示了與卡介苗種痘相似的保護(hù)作用,。兩個(gè)到三個(gè)這樣的刪除體的組合將提供一個(gè)在人體內(nèi)相對安全的優(yōu)點(diǎn)。但是人們?nèi)耘f認(rèn)為這樣的突變體（在體內(nèi)）限制性的復(fù)制可能會(huì)提供相對可觀的免疫原性和長期的保護(hù)作用,。也可能是這樣的突變體帶來的毒性太大以至于削弱了這樣的保護(hù)作用,。
Giv突變體在體內(nèi)生長也是缺陷的，但仍舊沒有達(dá)到前面提到的sgiv突變體相當(dāng)?shù)某潭?。Giv突變體,，例如,，結(jié)合菌醇-phthiocerol dimycocerosate突變體，和plcABCD和secA2突變體,，似乎是缺乏與內(nèi)在的免疫反應(yīng)相互作用的能力,。這樣減少結(jié)核桿菌菌種毒性的突變體的重組可以提供足夠的免疫力低下的動(dòng)物的安全性，如提到的panCD突變體,，但仍允許有限的復(fù)制和獲得可觀的免疫原性,。可以加入Pat突變體,，它具有減少的免疫病原體,，或者加入dis突變體，它具有減少的肺外擴(kuò)散的能力,，通過進(jìn)一步減少疾病和分化的危險(xiǎn),，能夠提高這樣疫苗的安全性。
關(guān)于面對獲得性免疫性反應(yīng)的持久性缺陷的per突變體更多的知識,，將有助于提高我們對結(jié)核桿菌采取的適應(yīng)性存活機(jī)制的理解,。這種知識將能夠產(chǎn)生新的免疫治療（方案），包括增強(qiáng)減毒的結(jié)核桿菌的免疫原性的策略,，甚至可能設(shè)計(jì)可以減少已存在的結(jié)核桿菌感染的有效的治療疫苗,。這樣，理想疫苗的候選人可能是這些類別的突變體的混合物,，是比卡介苗更安全更有效的替代物,。因?yàn)槠惹械匦枰_發(fā)新的治療策略和疫苗去解決這個(gè)全球的健康危機(jī)，因此,，（未來）努力的焦點(diǎn)將會(huì)是力求闡明結(jié)核桿菌這個(gè)作為成功的病原體的策略,。
