陳建忠
浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所
1 簡(jiǎn)介
免疫系統(tǒng)的基本功能是識(shí)別外源抗原并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一系列反應(yīng)清除外源致病性物質(zhì)，以保持機(jī)體的穩(wěn)定,。機(jī)體對(duì)病毒和細(xì)菌的初次免疫應(yīng)答一般認(rèn)為是非特異性的,，然而,Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)的發(fā)現(xiàn)則徹底改變了這一看法,。Janeway等[1]將天然免疫細(xì)胞所識(shí)別的主要靶分子稱(chēng)之為病原相關(guān)的分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs), PAMPs是眾多微生物共有的一種保守的模式分子,，廣泛存在于病原體細(xì)胞表面, 如內(nèi)毒素,、肽聚糖,、鞭毛蛋白、雙鏈RNA以及酵母細(xì)胞壁上的甘露糖等,。識(shí)別PAMPs的受體稱(chēng)為模式識(shí)別受體(pattern recognitionreceptor,，PRRs)。TLRs分子即是一類(lèi)重要的PRR, 迄今已在哺乳類(lèi)動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)10種TLR,，稱(chēng)為T(mén)LR受體家族[2-4],。TLR在結(jié)構(gòu)上與果蠅Toll受體存在同源性，為Ⅰ型跨膜蛋白,，胞外區(qū)有富含亮氨酸重復(fù)區(qū)(LRR), 胞內(nèi)區(qū)存在一段序列保守區(qū),，該序列與IL-1受體的胞內(nèi)區(qū)的保守序列有高度同源性，被稱(chēng)為T(mén)oll/IL-1R(TIR)區(qū)域,，與信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān),。不同的TLR識(shí)別相應(yīng)的PAMP, 如TLR4能識(shí)別LPS, TLR5識(shí)別鞭毛蛋白，TLR3識(shí)別dsRNA,，TLR9可識(shí)別非甲基化CpGDNA,，TLR7能識(shí)別抗病毒化合物，TLR2主要識(shí)別脂蛋白和糖脂包括酵母細(xì)胞壁,、肽聚糖等,，另外TLR1和TLR6能與TLR2形成復(fù)合受體識(shí)別一些微生物成分，目前TLR8和TLR10的配體尚不清楚,。TLR識(shí)別配體后,，可通過(guò)MyD88依賴(lài)性和非依賴(lài)型信號(hào)傳導(dǎo)途徑，激活NF-kB和MAPK,，可引起細(xì)胞因子如IL-6,、IL-12和TNF-α的釋放，上調(diào)APC細(xì)胞表面CD80,、CD86等共刺激分子并最終激活特異性免疫系統(tǒng),。本文主要對(duì)近年來(lái)TLR3的研究進(jìn)展作一綜述。
2 TLR3識(shí)別dsRNA功能的發(fā)現(xiàn)
病毒感染時(shí)可在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制產(chǎn)生雙鏈RNA（dsRNA）,dsRNA可與細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA依賴(lài)的蛋白激酶（dsRNA-dependent protein kinase,PKR）結(jié)合誘導(dǎo)抗病毒反應(yīng)[5],，但研究發(fā)現(xiàn)PKR基因敲除小鼠仍能對(duì)dsRNA的類(lèi)似物polyI:C起反應(yīng)[6],，提示細(xì)胞表面存在另外一種能識(shí)別dsRNA的受體。1997年Janeway[7]克隆到一系列TLR基因,，但某些TLR的配體尚不清楚,，為確定dsRNA受體，Alexopoulou[8]等將TLR1-6和TLR9以及NF-kB報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,，觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)polyI:C的反應(yīng)性,，發(fā)現(xiàn)僅表達(dá)TLR3的293細(xì)胞對(duì)其起反應(yīng),，而其他的TLR均不起作用，表明TLR3有結(jié)合polyI:C的功能,。隨后他們用同源重組技術(shù)建立了TLR3基因敲除小鼠,，與野生型相比，來(lái)自TLR3敲除小鼠的巨噬細(xì)胞經(jīng)polyI:C刺激后細(xì)胞因子如IL-6,、IL-12和TNF-α的能力均下降,，而用其他刺激劑如LPS、PGN以及CpG DNA刺激時(shí)這些細(xì)胞因子的產(chǎn)生沒(méi)有變化,。作者同時(shí)觀察了TLR2和TLR3基因敲除及野生型小鼠的B細(xì)胞對(duì)polyI:C或LPS刺激時(shí)細(xì)胞表面的CD80和CD86的表達(dá)水平,，TLR2基因敲除和野生型小鼠的B細(xì)胞經(jīng)polyI:C刺激后這些分子表達(dá)上調(diào)，而TLR3基因敲除小鼠的B細(xì)胞對(duì)LPS有反應(yīng),，而對(duì)polyI:C無(wú)反應(yīng),，說(shuō)明TLR3對(duì)polyI:C的識(shí)別具有特異性，若用Lang mammalian virus的基因組dsRNA刺激,，也出現(xiàn)同樣的結(jié)果,，提示TLR3還能識(shí)別病毒的dsRNA，上述研究結(jié)果證實(shí),，TLR3就是識(shí)別dsRNA的特異性受體,。
3 TLR3的分子學(xué)特征及其表達(dá)
人TLR3基因定位于4q35[9]，由2712核苷酸組成,，編碼由904個(gè)氨基酸組成蛋白質(zhì),，其中前21個(gè)氨基酸組成信號(hào)肽，第21-904為成熟的TLR3分子,，與其他TLR家族成員一樣,，TLR3屬于Ⅰ型跨膜受體，細(xì)胞外含有22個(gè)LRR,，跨膜區(qū)由21個(gè)氨基酸(705-725)組成,，細(xì)胞內(nèi)有TIR結(jié)構(gòu)域（754-896）。小鼠TLR3比人TLR3多一個(gè)氨基酸,，其中1-25為信號(hào)肽,，26-705為細(xì)胞外區(qū)，含有22個(gè)LRR,，跨膜區(qū)由21個(gè)氨基酸(706-726)組成,，755-897為其TIR結(jié)構(gòu)域。
與其他TLR相比較,，TLR3獨(dú)特的結(jié)構(gòu)是其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中不含有其他TLR中保守的脯氨酸,，而是由丙氨酸替代，這種替代在人和小鼠中是保守的,，在TLR4中,，該氨基酸的改變將導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)的中斷,，不能產(chǎn)生MyD88依賴(lài)和非依賴(lài)的信號(hào)傳導(dǎo)。C3H/HeJ小鼠對(duì)LPS無(wú)反應(yīng)性,，正是由于該氨基酸突變?yōu)榻M氨酸,，目前對(duì)該氨基酸替代在TLR3信號(hào)傳導(dǎo)中的意義上不清楚。
人和小鼠TLR3的表達(dá)譜不一樣,，具有種屬特異性[10],，Northern雜交分析[11],，人TLR3 mRNA只在骨髓來(lái)源的DC中檢測(cè)到,，且表達(dá)TLR3的DC一般位于淋巴結(jié)的T細(xì)胞定居區(qū)。而在其他血液細(xì)胞如單核細(xì)胞,，粒細(xì)胞,，NK細(xì)胞，T細(xì)胞和B細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞中均不能檢測(cè)到,，皮膚中的朗漢氏細(xì)胞不表達(dá)TLR3,，相反小鼠TLR3能在巨噬細(xì)胞中表達(dá)且能被LPS刺激后高水平表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)這種特異性表達(dá)與其啟動(dòng)子的基因序列密切相關(guān),，兩種TLR3的近端啟動(dòng)子區(qū)以及編碼5端外顯子的序列完全不同[10],，表明其中一種在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了變異。研究還發(fā)現(xiàn),，TLR3的表達(dá)受IFN的調(diào)節(jié),，病毒感染后也可通過(guò)IFN的介導(dǎo)上調(diào)TLR3的表達(dá)[12]。
3 TLR3的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其介導(dǎo)的生物學(xué)活性
TLR3的信號(hào)傳導(dǎo)包括兩條途徑,，即MyD88依賴(lài)和非依賴(lài)途徑,。
3.1 MyD88依賴(lài)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑[2-4]
MyD88依賴(lài)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑是TLR信號(hào)傳導(dǎo)的共同途徑，TLR2,4,7,9的信號(hào)傳導(dǎo)也均通過(guò)該途徑,。在MyD88依賴(lài)性途徑中,當(dāng)相應(yīng)配體同TLR結(jié)合后可促使受體發(fā)生二聚化,，其胞質(zhì)區(qū)通過(guò)TIR結(jié)構(gòu)域募集MyD88。結(jié)合后引發(fā)的下游事件主要包括以下幾個(gè)方面:(1)MyD88通過(guò)TIR區(qū)與TLR胞內(nèi)區(qū)的TIR區(qū)結(jié)合,，作為接頭蛋白募集IRAK(IL-1受體相關(guān)激酶); (2)IRAK結(jié)合TNF受體相關(guān)因子6(TRAF6)從而活化TAK1; (3)TRAF6的活化引起兩條不同途徑的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo):一條包括p38MAPK家族和c-Jun N-端激酶Jnk;另一條是包括Rel家族轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的途徑,。Alexopoulou[8]等利用MyD88基因敲除小鼠研究發(fā)現(xiàn)MyD88與dsRNA刺激TLR3介導(dǎo)的信號(hào)傳遞有關(guān)，用polyI:C刺激野生型小鼠DC能誘導(dǎo)IL-12和IL-6的產(chǎn)生,，且呈劑量依賴(lài)性關(guān)系,，而MyD88-/-小鼠中只能檢測(cè)痕量表達(dá)，同樣結(jié)果也見(jiàn)于巨噬細(xì)胞,，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,，dsRNA通過(guò)TLR3介導(dǎo)誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生依賴(lài)于MyD88信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
3.2 MyD88非依賴(lài)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑
早期研究表明,，polyI:C能誘導(dǎo)NF-kB和MAPK的活化,，Alexopoulou[8]比較了MyD88基因敲除小鼠級(jí)野生型小鼠對(duì)polyI:C誘導(dǎo)的NF-kB和MAPK的動(dòng)力學(xué),，研究發(fā)現(xiàn)NF-kB和MAPK的活化的動(dòng)力學(xué)相似，表明TLR3介導(dǎo)的信號(hào)途徑中存在著MyD88非依賴(lài)途徑,。近來(lái)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)小組分別報(bào)道兩個(gè)接頭蛋白即TRIF[13]或TICAM-1[14],，他們能介導(dǎo)TLR3誘導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生，表明該接頭蛋白可能與MyD88非依賴(lài)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān),，過(guò)度表達(dá)TRIF不但能誘導(dǎo)IFN-β報(bào)告基因的高表達(dá),，而且還能與內(nèi)源性的IRF3發(fā)生共沉淀，后者是誘導(dǎo)IFN-β產(chǎn)生的主要轉(zhuǎn)錄因子,，TRIF基因敲除小鼠TLR3和TLR4介導(dǎo)的IRF3磷酸化以及IFN-β的表達(dá)均發(fā)生缺陷[15],，新近兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室分別證明兩個(gè)IKK相關(guān)激酶IKKε和TBK1與病毒感染時(shí)IRF3/IRF7活化的上游途徑有關(guān)[16，17],，生物化學(xué)方法研究表明IKKε和TBK1均能磷酸化IRF3/IRF7,，并與IRF3和IRF7發(fā)生共沉淀，研究還證實(shí)TRIF能通過(guò)IKKε和TBK1誘導(dǎo)IRF3磷酸化,，該過(guò)程可被IKKε和TBK1的特異性干擾RNA阻斷,。
因此，TLR3可通過(guò)MyD88依賴(lài)途徑誘導(dǎo)炎癥性細(xì)胞因子如IL-1,、TNF-α,、IL-6和IL-12的表達(dá)，參與非特異性抗病毒反應(yīng),，同時(shí)通過(guò)MyD88非依賴(lài)途徑誘導(dǎo)共刺激分子CD80和CD86以及IFN-β,、IP-10等抗病毒性細(xì)胞因子的表達(dá)，參與誘導(dǎo)DC的分化成熟以及抗病毒免疫反應(yīng)[18],。此外TLR3可能還能誘導(dǎo)其他信號(hào)途徑,，有研究報(bào)道[19]dsRNA誘導(dǎo)的TLR3介導(dǎo)的561基因的表達(dá)依賴(lài)于TLR3胞內(nèi)區(qū)酪氨酸殘基的磷酸化，酪氨酸激酶抑制劑能抑制561基因的表達(dá),。TLR3的胞內(nèi)區(qū)有5個(gè)酪氨酸,，突變分析提示Tyr759的磷酸化對(duì)該基因的誘導(dǎo)起著關(guān)鍵的作用，推測(cè)這些酪氨酸位點(diǎn)可能是蛋白激酶或接頭蛋白的錨定位點(diǎn),，誘導(dǎo)不同的信號(hào)途徑激活靶基因,。另外也有人報(bào)道，TLR3可直接與TRAF6結(jié)合啟動(dòng)下游途徑,，誘導(dǎo)NF-κB和MAPK的活化[20],。
結(jié)語(yǔ)
自從TLR發(fā)現(xiàn)以來(lái)，該領(lǐng)域的研究取得長(zhǎng)足的進(jìn)步,，但是仍有許多問(wèn)題尚未解決,。如TLR與配體結(jié)合機(jī)制，某些TLR的天然配體尚未鑒定,，在信號(hào)傳導(dǎo)方面,，不同的TLR如何誘導(dǎo)特異性的信號(hào)通路調(diào)節(jié)不同基因的表達(dá)以介導(dǎo)不同的生物學(xué)效應(yīng),，就TLR3而言，TLR3能否識(shí)別病毒還存在爭(zhēng)論,，在人和小鼠中,，產(chǎn)生IFN的PDC的細(xì)胞表面不表達(dá)TLR3, 而表達(dá)TLR7和TLR9, 提示TLR3可能不是主要的識(shí)別病毒的受體，另外在DC的不同分化階段TLR3的表達(dá)不一樣,，提示TLR3參與DC功能的調(diào)節(jié),，這些問(wèn)題的闡明，將有助于我們了解機(jī)體抗病毒反應(yīng)的機(jī)制,，為臨床治療奠定基礎(chǔ),。
參考文獻(xiàn)
1 Ruslan Medzhitov and Charles A. Janeway Jr.Innate Immunity: The Virtues of a Nonclonal System of Recognition cell.1997；91:295-298 1997
2 Akira S, Hemmi H.Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family. Immunol Lett. 2003;85(2):85-95.
3 Takeda K, Kaisho T, Akira S. Toll-like receptors. Annu Rev of Immunol. 2003, 21: 335-376.
4 Takeda K, Akira S. Toll receptors and pathogen resistance. Cellular Microbiology.2003, 5:143-53.
5 Clemens MJ, Elia A. The double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR: structure and function. J Interferon Cytokine Res .1997,17:503-524
6 Maggi LB,，Heitmeier MR,，Scheuner D，et al.Potential role of PKR in double-stranded RNA-induced macrophage activation. EMBO J. 2000, 19: 3630-3638.
7 Schwarz K, Storni T, Manolova V, Didierlaurent A, Sirard JC, Rothlisberger P, Bachmann MF. Role of Toll-like receptors in costimulating cytotoxic T cell responses.Eur J Immunol. 2003;33(6):1465-70.
8 Alexopoulou L, Holt AC. Medzhitov R et al. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature. 2001,413:732-8.
9 Datta SK, Redecke V, Prilliman KR, Takabayashi K, Corr M, Tallant T, DiDonato J, Dziarski R, Akira S, Schoenberger SP, Raz E.A subset of Toll-like receptor ligands induces cross-presentation by bone marrow-derived dendritic cells. J Immunol. 2003;170(8):4102-10.
10 Heinz S, Haehnel V, Karaghiosoff M, Schwarzfischer L, Muller M, Krause SW, Rehli M.Species-specific Regulation of Toll-like Receptor 3 Genes in Men and Mice.J Biol Chem. 2003;278(24):21502-9.
11 Muzio M, Bosisio D, Polentarutti N, D'amico G, Stoppacciaro A, Mancinelli R, van't Veer C, Penton-Rol G, Ruco LP, Allavena P, Mantovani A.Differential expression and regulation of toll-like receptors (TLR) in human leukocytes: selective expression of TLR3 in dendritic cells.J Immunol. 2000;164(11):5998-6004.
12 Miettinen M, Sareneva T, Julkunen I, Matikainen S. IFNs activate toll-like receptor gene expression in viral infections. Genes Immun. 2001 Oct;2(6):349-55.
13 Yamamoto M, Sato S, Mori K, et al. Cutting edge: a novel Toll/IL-1 receptor domain-containing adapter that preferentially activates the IFN-beta promoter in the Toll-like receptor signaling. J Immunol. 2002, 169:6668-72.
14 Oshiumi H, Matsumoto M, Funami K, et al. TICAM-1, an adaptor molecule that participates in Toll-like receptor 3-mediated interferon-beta induction. Nat Immunol. 2003, 4:161-7.
15 Yamamoto M, Sato S, Hemmi H, Hoshino K, Kaisho T, Sanjo H, Takeuchi O, Sugiyama M, Okabe M, Takeda K, Akira S. Role of Adaptor TRIF in the MyD88-Independent Toll-Like Receptor Signaling Pathway. Science. 2003 Jul 10 [in press]
16 Sharma S, tenOever BR, Grandvaux N, Zhou GP, Lin R, Hiscott J. Triggering the interferon antiviral response through an IKK-related pathway. Science. 2003;300(5622):1148-51
17 Fitzgerald KA, McWhirter SM, Faia KL, Rowe DC, Latz E, Golenbock DT, Coyle AJ, Liao SM, Maniatis T. IKKepsilon and TBK1 are essential components of the IRF3 signaling pathway. Nat Immunol. 2003 ;4(5):491-6.
18 Doyle SE, O'Connell R, Vaidya SA, Chow EK, Yee K, Cheng G. Toll-like receptor 3 mediates a more potent antiviral response than Toll-like receptor 4.J Immunol. 2003;170(7):3565-71.
19 Sarkar SN, Smith HL, Rowe TM, Sen GC.Double-stranded RNA signaling by Toll-like receptor 3 requires specific tyrosine residues in its cytoplasmic domain.J Biol Chem. 2003;278(7):4393-6.
20 Jiang Z, Zamanian-Daryoush M, Nie H,et al. Poly(dI.dC)-induced Toll-like receptor 3 (TLR3)-mediated activation of NFkappa B and MAP kinase is through an interleukin-1 receptor-associated kinase (IRAK)-independent pathway employing the signaling components TLR3-TRAF6-TAK1-TAB2-PKR. Biol Chem. 2003, 278:16713-9.
