2012年8月31日,，北京生命科學(xué)研究所所邵峰博士實驗室在Cell雜志上發(fā)表題為Structurally Distinct Bacterial TBC-like GAPs Link Arf GTPase to Rab1 Inactivation to Counteract Host Defenses的文章。該文章報道了志賀氏痢疾桿菌和腸致病大腸桿菌利用一類具有全新結(jié)構(gòu)模式的毒力效應(yīng)蛋白分子,模擬宿主TBC樣GAP的作用方式特異性失活宿主小G蛋白Rab1,，最終分別實現(xiàn)對宿主自噬通路和炎癥因子分泌所介導(dǎo)的抗感染防御通路的抑制,。
通過三型分泌系統(tǒng)分泌毒力效應(yīng)蛋白分子進入真核宿主體內(nèi),，進而阻斷或調(diào)節(jié)宿主抗微生物感染相關(guān)的防御信號通路是許多革藍氏陰性病原菌普遍采用的致病機制。志賀氏痢疾桿菌(Shigella flexneri)和腸致病大腸桿菌(Enteropathogenic E. coli)均為腸道病原菌,，感染導(dǎo)致腹瀉,前者為侵襲性胞內(nèi)菌,，而后者則在腸上皮細(xì)胞外生存和繁殖,。早在1995年研究人員就發(fā)現(xiàn)痢疾桿菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存復(fù)制依賴于其三型分泌系統(tǒng)分泌的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白VirA。VirA缺失的痢疾桿菌突變體在宿主細(xì)胞內(nèi)生存能力的下降可以被異源表達來自腸致病大腸桿菌的效應(yīng)蛋白EspG所彌補,。對腸致病大腸桿菌本身來說,，EspG只在小鼠感染模型中顯示出促進細(xì)菌生存的作用。VirA與EspG具有大約20%的序列同源性,，提示他們的生物化學(xué)活性可能具有一定程度的相似性,。然而17年來關(guān)于VirA和EspG的宿主靶蛋白分子是什么以及它們的生物學(xué)功能機制一直不清楚。
在這項研究中,，邵峰博士實驗室的研究人員首先巧妙地利用了VirA抑制酵母菌生長的表型,，篩查了VirA和EspG中保守的46個氨基酸殘基，最終找到185位的天冬氨酸,、188位的精胺酸和280位的谷氨酰胺對于VirA抑制酵母菌生長必不可少,。他們進一步發(fā)現(xiàn)188位的精胺酸甚至不能被性質(zhì)相近的賴氨酸所替換。這個發(fā)現(xiàn)使他們聯(lián)想到負(fù)責(zé)催化小G蛋白GTP水解的GAP（GTPase-activating protein）蛋白中的關(guān)鍵精胺酸也具有類似的特性,，在這個想法的指導(dǎo)下,，他們重新分析了VirA和EspG的序列，發(fā)現(xiàn)上述三個關(guān)鍵殘基及其周圍的序列和作用于Rab家族小G蛋白的TBC樣GAP蛋白中的精氨酸和谷氨酰胺“催化雙指”活性區(qū)域有高度的相似性,。在后續(xù)一系列生物化學(xué),，酶學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的實驗中，研究人員不僅發(fā)現(xiàn)VirA和EspG具有比宿主TBC樣GAP更強的催化活性,，而且還篩選和鑒定出Rab1為VirA和EspG最合適的底物和宿主靶蛋白,。有意思的是，細(xì)菌感染實驗結(jié)果顯示,，痢疾桿菌利用VirA對Rab1的特異失活作用來抑制宿主細(xì)胞對胞內(nèi)痢疾桿菌的自噬清除,，從而促進該菌的胞內(nèi)生存。與VirA不同,，腸致病大腸桿菌則利用EspG對Rab1的催化失活來阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到順式高爾基體的膜泡運輸,，從而破壞宿主細(xì)胞的胞外分泌信號通路。研究人員也確實發(fā)現(xiàn)在腸道感染炎癥反應(yīng)中起重要作用的白介素8的分泌會被EspG有效抑制,，這也解釋了為什么EspG缺失的突變體細(xì)菌只在小鼠感染實驗中才顯示出毒性減弱的表型,。
通過和浙江大學(xué)朱永群教授合作，他們解析了VirA和EspG分別與Rab1形成的催化中間體復(fù)合物的三維晶體結(jié)構(gòu),，并發(fā)現(xiàn)VirA和EspG結(jié)構(gòu)相似,，但采用與真核細(xì)胞中的TBC樣GAP完全不同的三維折疊模式。深入的結(jié)構(gòu)分析不僅揭示了VirA和EspG識別Rab1的具體分子機制,，同時還證明了VirA和EspG活性中心的精氨酸和谷氨酰胺殘基采取了與TBC樣GAP非常類似的“雙指”催化方式,。此前曾有報道，EspG可以和小G蛋白Arf1/6相互作用，這項研究的作者也進一步解析了Arf6-EspG-Rab1的三元復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu),。該結(jié)構(gòu)清晰地展示了EspG分子利用同一側(cè)的兩個不同的表面分別結(jié)合Arf和Rab1,，并且Arf是以活性狀態(tài)結(jié)合在EspG上的，直接說明了EspG是通過和Arf1的特異性結(jié)合準(zhǔn)確定位到順式高爾基體相關(guān)的膜泡上,，進而有效接近并催化Rab1中GTP水解和Rab1失活,，以抑制宿主炎癥因子的分泌。
這項研究發(fā)現(xiàn)痢疾桿菌和腸致病大腸桿菌利用一類具有全新結(jié)構(gòu)模式,，但采用和宿主TBC樣GAP類似 “催化雙指”機制的毒力效應(yīng)蛋白分子,，特異性識別并失活宿主小G蛋白Rab1，分別實現(xiàn)對宿主自噬作用和炎癥因子分泌所介導(dǎo)的抗感染防御通路的抑制,。同時這項研究成果也預(yù)示TBC樣GAP可能被許多其它病原菌廣泛采用來拮抗宿主的防御信號通路,，同時也豐富和深入了人們對GAP蛋白結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的認(rèn)識。
邵峰實驗室的博士后董娜和浙江大學(xué)的朱永群博士為本文共同第一作者,；朱永群博士完成了本文中的結(jié)構(gòu)生物學(xué)部分的主要工作,；其他參加該工作的還有邵峰實驗室的博士后陸秋鶴、技術(shù)員胡麗燕和鄭玉清,。邵峰博士和朱永群博士為本文共同通訊作者,。
此項研究為科技部973和北京市科委資助課題，邵峰博士實驗室還得到美國霍華德-休斯醫(yī)學(xué)研究所資助,，朱永群博士實驗室則由浙江大學(xué)的啟動經(jīng)費資助,。（生物谷Bioon.com）
doi:10.1016/j.cell.2012.06.050
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Structurally Distinct Bacterial TBC-like GAPs Link Arf GTPase to Rab1 Inactivation to Counteract Host Defenses
Na Dong, Yongqun Zhu, Qiuhe Lu, Liyan Hu, Yuqing Zheng, Feng Shao
Rab GTPases are frequent targets of vacuole-living bacterial pathogens for appropriate trafficking of the vacuole. Here we discover that bacterial effectors including VirA from nonvacuole Shigella flexneri and EspG from extracellular Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) harbor TBC-like dual-finger motifs and exhibits potent RabGAP activities. Specific inactivation of Rab1 by VirA/EspG disrupts ER-to-Golgi trafficking. S. flexneri intracellular persistence requires VirA TBC-like GAP activity that mediates bacterial escape from autophagy-mediated host defense. Rab1 inactivation by EspG severely blocks host secretory pathway, resulting in inhibited interleukin-8 secretion from infected cells. Crystal structures of VirA/EspG-Rab1-GDP-aluminum fluoride complexes highlight TBC-like catalytic role for the arginine and glutamine finger residues and reveal a 3D architecture distinct from that of the TBC domain. Structure of Arf6-EspG-Rab1 ternary complex illustrates a pathogenic signaling complex that rewires host Arf signaling to Rab1 inactivation. Structural distinctions of VirA/EspG further predict a possible extensive presence of TBC-like RabGAP effectors in counteracting various host defenses.
