楊友,，陳惠金,，錢龍華，蔣明華
（上海第二醫(yī)科大學附屬新華醫(yī)院,，上海 200092）
摘要：目的 探討腦缺氧缺血（HI）對葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（glucose transporter1,，GLUT1）和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白3（glucose transporter3，GLUT3）合成的影響,。方法 在成功建立了缺氧缺血新生大鼠模型的基礎(chǔ)上,，應(yīng)用免疫組化方法檢測缺氧缺血新生大鼠腦內(nèi)海馬和皮質(zhì)部位GLUT1和GLUT3的合成情況。結(jié)果 正常情況下,，海馬和皮質(zhì)部位GLUT1和GLUT3的合成量隨日齡增加而增高,。海馬部位的合成量高于皮質(zhì)部位；缺氧缺血可引起GLUT1和GLUT3的合成增加,，HI后24h時達到高峰,，其后呈下降趨勢，尤其是GLUT3在HI后7d降至極低水平,。皮質(zhì)部位的合成量高于海馬部位,。結(jié)論 HI可調(diào)控腦內(nèi)GLUT1和GLUT3水平，使其在HI后短期內(nèi)合成增高,，以增加腦內(nèi)葡萄糖的轉(zhuǎn)運,，適應(yīng)無氧酵解增加的需要。
關(guān)鍵詞： 嬰兒,；新生兒,；腦缺氧缺血；葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1,；葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白3
中圖分類號：Q 文獻標識碼：
Effect of cerebral hypoxic ischemia on the synthesis of glucose transporters 1 and 3 in neonatal rats
YANG You, CHEN Hui-jin, QIAN Long-hua, JIANG Ming-hua
(Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Second Medical University, Shanghai 200092,，China)
Abstract： Objective To explore the effect of cerebral（hypoxic-ischemia）HI on the synthesis of glucose transporter( GLUT)1 and 3. Method Based on the successful preparation of hypoxic-ischemic neonatal rat model, immunohistochemical method was applied to detect the synthesis of GLUT1 and GLUT3 in cerebral hippocampus and cortex in neonatal rats with HI. Results There was a linear enhancement in the synthesis of GLUT1 and GLUT3 with the increase of day age. The synthesis was predominant in hippocampus comparing to that in cortex in normal group. However, HI could significantly enhance the synthesis of GLUT1 and GLUT3 in the early time after HI. The synthesis reached peak at 24 h after HI, and then declined, especially GLUT3 went down to a very low level at day 7 after HI. It was noticed that the synthesis was more in cortex than that in hippocampus in HI group. Conclusion It is suggested that the increased synthesis of GLUT1 and GLUT3
基金項目：國家自然科學基金資助項目（30070789） 通訊作者：陳惠金 作者簡介：楊友（1976－）,，男，回族,，河南人，碩士,，從事新生兒缺氧缺血性腦病的發(fā)病機制及防治研究 E-mail： 聯(lián)系電話： （021）65790000轉(zhuǎn)7416
收稿日期：2003-07-06
induced by HI could accelerate the utilization of glucose in the brain and adapt to the requirement of anaerobic glycolysis.
Key words： infant; neonate; brain hypoxic-ischemia; GLUT1; GLUT3
近年來研究表明,，缺氧缺血導致腦內(nèi)代謝異常乃至能量衰竭，是引起腦組織損傷壞死的重要原因之一,。腦的生化代謝特點決定腦組織必須依賴于葡萄糖的持續(xù)有氧氧化才能維持正常的腦代謝活動,。體內(nèi)葡萄糖由血液通過血腦屏障進入腦細胞，需要相應(yīng)的運載工具,，一組葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白就起著運送葡萄糖進入相應(yīng)組織的作用,。目前已證實體內(nèi)至少有5種以上葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白異構(gòu)體，其中GLUT1主要位于腦內(nèi)血管內(nèi)皮細胞,，GLUT2位于體內(nèi)肝,、腸、腎及胰腺β細胞部位,，GLUT3位于神經(jīng)細胞部位,，GLUT4位于脂肪、心肌及骨骼肌等部位,，GLUT5則主要位于小膠質(zhì)細胞部位,。在腦內(nèi)，負責運送葡萄糖的轉(zhuǎn)運蛋白主要為GLUT1和GLUT3,，在其所在于的相應(yīng)內(nèi)皮細胞及神經(jīng)細胞內(nèi)均有較高含量,。腦內(nèi)也可檢測到GLUT2,GLUT4以及GLUT7，但含量甚低[1],。在腦的能量代謝過程中,，GLUT1和GLUT3這兩個直接涉及腦內(nèi)葡萄糖的轉(zhuǎn)運和利用的蛋白質(zhì)起了十分關(guān)鍵的作用。研究顯示,，不僅不同的血糖濃度可調(diào)節(jié)GLUT1和GLUT3的生成增高或降低,，使腦內(nèi)能量代謝的恒定需要得以維持，而且GLUT1和GLUT3的生成也受缺氧缺血的調(diào)控,，從而顯著影響GLUT基因的表達和相應(yīng)蛋白質(zhì)的翻譯合成,，乃至影響腦的能量代謝甚至能量衰竭[1~3]。本研究在成功建立了缺氧缺血新生大鼠模型的基礎(chǔ)上,，應(yīng)用免疫組化方法,，在國內(nèi)首次對缺氧缺血新生大鼠腦內(nèi)GLUT1和GLUT3的合成進行定量測定和分析。
1 材料與方法
1.1 主要儀器和試劑 一套缺氧裝置包括缺氧箱[4],、恒溫槽和8％低氧源等,、恒冷切片機（德國Leica公司CM900）,、光學顯微鏡以及手術(shù)器械等；GLUT1 和GLUT3多克隆抗體,、ABC試劑盒（Santa Cruz公司）,。
1.2 實驗動物及分組 7日齡SD新生大鼠，無性別選擇,。由第二軍醫(yī)大學動物中心提供,。75只新生大鼠隨機分成正常組、假手術(shù)組,、缺氧缺血組共3組,，每組25只；每組又分成 2,，24,，48，72 h和7d共5個時段,，每時段5只,。
1.3 腦缺氧缺血（HI）新生大鼠動物模型的建立 7日齡新生SD大鼠仰臥固定于手術(shù)板上，酒精局部消毒,，顯微剪作頸部正中切口,，分離和結(jié)扎右頸總動脈，隨后將缺血后新生大鼠置恒溫37℃,8%低氧箱內(nèi)缺氧2h,。各組新生大鼠均返回母鼠身邊繼續(xù)喂養(yǎng),。其中假手術(shù)組模型的制備為在頸部作一切口，分離右頸總動脈后不予結(jié)扎,，縫合頸部切口[5],。
1.4 腦標本制備 處死前應(yīng)用4％多聚甲醛心臟灌注內(nèi)固定15min后，各組新生大鼠于相應(yīng)時段斷頭處死,，腦組織置于4％多聚甲醛固定6h,，隨后移至30％蔗糖溶液內(nèi)，放置4℃冰箱內(nèi)待大腦組織下沉（約需時2d）,。取出大腦予OCT包埋劑包埋,，置－80℃冰箱內(nèi)待冷凍切片。
1.5 冷凍切片 應(yīng)用恒冷切片機（德國Leica公司CM900）進行由額至枕部的冠狀位全腦組織冷凍連續(xù)切片,，選擇腦片部位相當于耳間線前2mm水平[6],，腦片厚約8μm。
1.6 GLUT1和GLUT3的免疫組織化學檢測 腦片滴加足夠的0.3％H2O2 PBS液,，室溫下孵育10min,，漂洗后用5％驢血清孵育1h，再用一抗（切片只加一種多克隆抗體,，GLUT1為1:100稀釋于阻斷血清,，GLUT3為1:100稀釋于阻斷血清）濕盒內(nèi)25℃孵育2h,；漂洗后滴加二抗（生物素標記驢抗羊抗體，按血清75μl : PBS 5ml : 二抗25μl比例配制）濕盒內(nèi)25℃孵育1h,；按常規(guī)ABC法反應(yīng)檢測,，行DAB顯色反應(yīng)，蘇木精復(fù)染5min,，中性樹脂封固,。陰性對照則用 PBS代替一抗。
1.7 結(jié)果評估 應(yīng)用KS400圖像分析系統(tǒng),，光學顯微鏡400倍下觀察大腦海馬CA1區(qū)、CA2區(qū),、CA3區(qū),、CA4區(qū)、齒狀回（DG）區(qū)以及皮質(zhì)區(qū)部位GLUT1和GLUT3的合成情況,。血管內(nèi)皮部位呈現(xiàn)棕色陽性染色提示有GLUT1的合成,，神經(jīng)元部位呈現(xiàn)棕色陽性染色提示有GLUT3的合成，海馬和皮質(zhì)各觀察10個視野,。計算各視野棕色陽性染色面積占該視野總面積的百分率,，然后綜合10個視野的數(shù)據(jù)，得出平均陽性率,，以此分析和判斷各組各時段在不同腦區(qū)內(nèi)GLUT的合成情況,。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（ ）表示，應(yīng)用單因素方差分析及Newman-Keuls檢驗進行均數(shù)間兩兩比較,。
2 結(jié)果
2.1 正常組,、假手術(shù)組和HI組腦內(nèi)GLUT1在各時段的合成情況 正常組與假手術(shù)組在海馬及皮質(zhì)部位GLUT1的合成量隨日齡增加而相應(yīng)增加，海馬部位的合成量略高于皮質(zhì)部位的合成量,。缺氧缺血可明顯增加海馬部位和皮質(zhì)部位GLUT1的合成,，皮質(zhì)部位GLUT1的合成量普遍高于海馬部位，在HI后2h GLUT1合成增加,，HI后24h至48h合成量達高峰,，其后合成量漸趨下降。至HI后7d,，海馬和皮質(zhì)部位GLUT1的合成量均降至相當于對照組HI后2～24h的水平,。
2.1 正常組、假手術(shù)組和HI組腦內(nèi)GLUT3在各時段的合成情況 與GLUT1的合成相似,，正常組與假手術(shù)組在海馬及皮質(zhì)部位GLUT3的合成量隨著日齡的增加均有相應(yīng)增加的趨勢,，海馬部位的合成量略高于皮質(zhì)部位的合成量。缺氧缺血可明顯增加海馬部位和皮質(zhì)部位GLUT3的合成,，皮質(zhì)部位GLUT3的合成略高于海馬部位,，在HI后2h GLUT3的合成增加,，HI后24h至48h合成量達到高峰，其后合成量漸趨下降,，至HI后7d,，海馬和皮質(zhì)部位的合成量均顯著低于對照組水平。
3 討論
發(fā)育因素及缺氧缺血均可調(diào)控GLUT1和GLUT3的基因表達和產(chǎn)物合成,，由此影響腦的發(fā)育及腦的能量代謝[2,3,8],。圍產(chǎn)期腦缺氧缺血損傷是導致新生兒死亡及神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的主要原因，缺氧缺血常導致腦內(nèi)代謝異常甚至引起能量衰竭,，因而缺氧缺血很可能是調(diào)控GLUT1和GLUT3的基因表達和產(chǎn)物合成的重要因素之一,。 本研究在熟練掌握缺氧缺血新生大鼠模型制作的基礎(chǔ)上，采用GLUT1和GLUT3多克隆抗體,，應(yīng)用免疫組化方法對缺氧缺血新生大鼠腦內(nèi)的GLUT1和GLUT3進行測定,，并應(yīng)用KS400圖像分析系統(tǒng)計算GLUT1和GLUT3合成的陽性染色面積百分率，從而對正常和缺氧缺血新生大鼠在不同時段及不同腦區(qū)內(nèi)的GLUT1和GLUT3的合成情況進行比較評估,。
在免疫組化圖像中,，相對分子質(zhì)量為55 000 的GLUT1蛋白質(zhì)位于腦血管內(nèi)皮部位，呈條梭狀棕色陽性染色,；相對分子質(zhì)量為45 000 的GLUT3蛋白質(zhì)則位于腦組織神經(jīng)元的突觸末梢及小的突起部位,，呈小斑片狀棕色陽性染色[9]。
結(jié)果顯示,，正常新生大鼠在生后7～14日齡期間,，其腦內(nèi)GLUT1和GLUT3的合成量呈線性逐漸增加趨勢，反映了隨著腦組織的逐漸發(fā)育,，其腦的能量代謝需求也逐漸增加,。假手術(shù)組的結(jié)果與正常組相似，因而可以排除因單純手術(shù)對實驗的可能影響,。GLUT1和GLUT3在胚胎期即有大量合成,，胚胎期主要以葡萄糖的無氧酵解為主，大量合成GLUT可以和此期的能量代謝方式相適應(yīng),。隨著胎內(nèi)三羧酸循環(huán)所需呼吸鏈的發(fā)育成熟,，能量代謝方式漸以有氧氧化為主，GLUT的合成逐漸減少直至出生,。由于生后發(fā)育代謝的需要,，葡萄糖的攝入增加，促使GLUT的合成也逐漸增加,，以適應(yīng)發(fā)育代謝的需求[6],。已知GLUT的基因表達和產(chǎn)物合成主要受HIF-1、葡萄糖,、生長因子等因素的調(diào)控,。其中HIF-1可以調(diào)控數(shù)個涉及能量代謝包括GLUT的基因表達,，HIF-1是由HIF-1α及HIF-1β組成的異二聚體，其中HIF-1α對于HIF-1調(diào)控GLUT的表達可能起決定作用,，HIF-1β則主要在胚胎腦發(fā)育期起作用[10],。
本研究結(jié)果顯示，缺氧缺血可明顯增加GLUT1和GLUT3的合成量,，其中GLUT1在HI后2h合成增加,，HI后24h合成量達到高峰，其后合成量漸趨下降,，至HI后72h,，合成量回落至對照組水平。在皮質(zhì)部位的GLUT1合成高峰較海馬部位延續(xù)更長時間,，持續(xù)至HI后48h才漸趨回落,。同樣，GLUT3在HI后2h 合成增加,，HI后24h至48h合成量達到高峰,，其后合成量漸趨下降,，至HI后7d,，GLUT3的合成量則顯著低于對照組水平。研究表明血糖濃度本身也可調(diào)控GLUT的合成量,，且在較高濃度下顯示對神經(jīng)元高度的保護作用,。本課題組另有實驗顯示，在整體水平上,，HI應(yīng)激可使血糖濃度升高至(7.19±0.52)mmol/L,，與正常組（5~7 mmol/L）、HI合并輕度高血糖組(10~15 mmol/L)及HI合并重度高血糖組(16~25 mmol/L)血糖水平均有顯著意義差異,。
缺氧缺血時,，腦內(nèi)缺氧且能量物質(zhì)匱乏，腦組織只能依賴于效率極低的葡萄糖的無氧酵解,，此時GLUT的合成增加主要受HIF-1α的調(diào)控,，GLUT1的合成增加可加快葡萄糖由血液轉(zhuǎn)運入腦，GLUT3的合成增加則可加速神經(jīng)元的葡萄糖攝入,，得以補償腦內(nèi)能量物質(zhì)的嚴重匱乏,，適應(yīng)無氧酵解的需要，改善腦內(nèi)能量物質(zhì)的供應(yīng),。
GLUT3是位于神經(jīng)元部位,、負責供給神經(jīng)元能量的轉(zhuǎn)運蛋白。本研究結(jié)果顯示,，GLUT3的合成量在HI后7d顯著低于對照組水平,。引起這一現(xiàn)象的原因,，推測可能與缺氧缺血晚期，由于存在神經(jīng)元的壞死和丟失,，導致蛋白質(zhì)的合成中斷,，從而引起GLUT3的合成量明顯降低有關(guān)。位于海馬神經(jīng)元部位的GLUT3減少更為明顯,，也提示神經(jīng)元的損傷在海馬部位較之皮質(zhì)部位可能更趨嚴重,。引起缺氧缺血晚期GLUT3合成量降低的其他可能解釋尚有，缺氧缺血可引起腦內(nèi)一氧化氮（NO）及一氧化碳（CO）水平的升高,，兩者均可降低HIF-1α對GLUT3基因的轉(zhuǎn)錄活性[11],，因而減少了GLUT3的合成。此外,，缺氧缺血可引起GLUT3的蛋白變性,，可能未能被特異性的GLUT3相應(yīng)抗體所檢測到 [2,3]。對腦的神經(jīng)病理研究也顯示[2],，缺氧缺血后神經(jīng)元可處于不同的溶解階段,，在缺氧缺血早期即可發(fā)生GLUT3表達的中斷，在缺氧缺血晚期,，隨著神經(jīng)元損傷程度的加重和進一步壞死,，GLUT的合成被進一步影響，也可解釋為在缺氧缺血晚期GLUT3合成量減少的原因之一,。由于GLUT3的水平降低或消失,，使腦內(nèi)能量匱乏的惡性循環(huán)進一步加劇，還可影響其對突觸合成遞質(zhì)的特殊作用[12],。本室分研究對腦缺氧缺血新生大鼠模型成功進行了GLUT的合成研究,，結(jié)果提示缺氧缺血是調(diào)控GLUT合成的重要因素之一，在缺氧缺血早期可引起GLUT合成的上調(diào),，反映了腦內(nèi)存在著應(yīng)激缺氧缺血的代償機制,。缺氧缺血晚期則可導致GLUT合成的降低，提示由于神經(jīng)元的進一步壞死和丟失,，可能使蛋白質(zhì)的翻譯合成功能受阻,。GLUT合成的下調(diào)，可進一步加劇腦內(nèi)能量匱乏的惡性循環(huán),。對HI新生大鼠的腦病理研究和相應(yīng)GLUT的基因研究正繼續(xù)中,，期望與本室分研究結(jié)果一起為繼續(xù)進行不同葡萄糖濃度對缺氧缺血新生大鼠腦內(nèi)GLUT合成的可能影響研究奠定基礎(chǔ)。
參考文獻：
[1] Pessin JE, Bell GI. Mammalian facilitative glucose transporter family: structure and molecular regulation [J]. Annu Res Physiol, 1992,54:911-930.
[2] Vannucci SJ, Seaman LB, Vannucci RC. Effects of hypoxia-ischemia on GLUT1 and GLUT3 glucose transporters in immature rat brain[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 1996,16:77-81.
[3] Vannucci SJ, Reinhart R, Maher F, et al. Alterations in GLUT1 and GLUT3 glucose transporter gene expression following unilateral hypoxia-ischemia in the immature rat brain[J]. Brain Res Dev Brain Res, 1998,107:255-264.
[4] 陳惠金, 周建德, 周澤漢, 等. 新生大鼠缺氧試驗裝置的研制[J]. 上海實驗動物學,，1999,19 (1):45-46.
[5] 陳惠金, 周建德, 周澤漢, 等.新生大鼠腦缺氧缺血損傷模型的制備[J]. 上海實驗動物學,，1999, 19(3):159-166.
[6] Ota A, Ikeda T, Ikenoue T et al. Sequence of neuronal responses assessed by immunohistochemistry in the newborn rat brain after hypoxia-ischemia. Am J Obstet Gynecol, 1997,177:519-526.
[7] 包新民,舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1991.44
[8] Matsumoto K, Akazawa S, Ishibashi M, et al. Abundant expression of GLUT1 and GLUT3 in rat embryo during the early organogenesis period[J]. Biochem Biophysi Res Commun, 1995, 209:95-102.
[9] Urabe T, Hattori N, Nagamatsu S, et al. Expression of glucose transporters in rat brain following transient focal ischemic injury[J]. J Neurochem,1996,67:265-271.
[10] Royer C, Lachuer J, Crouzoulon G, et al. Effects of gestation on mRNA levels of Glut3 snd Glut4 transporters,hypoxia inducible factor-1 and thyroid hormone receptors in developing rat brain[J]. Brain Res, 2000, 856:119-128.
[11] Huang LE, Willmore WG, Gu J, et al. Inhibition of hypoxia-inducible factor 1 activation by carbon monoxide and nitric oxide[J].J Biol Chem,1999,274(13):9038-9044.
[12] McCall AL, Moholt-Siebert M, Vanburen A, Cherry NJ, et al. Progressive hippocampal loss of immunoreacative GLUT3, the neuron-specific glucose transporter, after global forebrain ischemia[J]. Brain Res, 1995,670:29-38.
