微生物學(xué)報(bào)Acta Microbiologica Sinica
48(3)：385~390; 4 March 2008
盧建紅**, 唐運(yùn)蓮**, 周鳴, 武明花, 歐陽(yáng)玨, 高建明, 張荔茗, 李丹, 陳瓊, 熊煒, 李小玲, 唐珂, 李桂源*
(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所, 長(zhǎng)沙 410078)
摘要：為了在Epstein-Barr 病毒(EBV)172kb 的基因組中引入突變以研究基因功能, 建立了一種簡(jiǎn)單有效的基因操作方法。在載體pcDNA3.1(+)上操作, 將兩端含有重組蛋白FLP 識(shí)別位點(diǎn)(FRT)的卡那霉素篩選標(biāo)記基因(kan)與鼻咽癌(NPC)來(lái)源的,、包含LMP1 基因全長(zhǎng)ORF 的gDNA“無(wú)縫”連接(無(wú)外源序列插入),。連接后的kan-LMP1 線性DNA 片段經(jīng)轉(zhuǎn)化、由λ噬菌體中redαβγ 系統(tǒng)介導(dǎo)在E.coli中發(fā)生同源重組(ET 克隆), 用kan-LMP1 替代了BAC-EBV(p2089)中相應(yīng)的LMP1 基因區(qū)域, 然后經(jīng)過(guò)重組蛋白FLP 對(duì)FRT-kan-FRT 特異性的識(shí)別, 切除了引入的kan 基因, 留下一個(gè)69bp 的FRT“疤痕”。通過(guò)抗性篩選和對(duì)菌液進(jìn)行PCR 擴(kuò)增可以鑒定突變子,。這種經(jīng)改進(jìn)并程序化的方法, 也適應(yīng)于引入其它突變或在其它BAC-皰疹病毒基因組中引入突變,。
關(guān)鍵詞：EB 病毒; 突變; 同源重組; 線性轉(zhuǎn)化
中圖分類(lèi)號(hào)：R739.63 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0001-6209 (2008) 03-0385-06
皰疹病毒科的成員是感染人和動(dòng)物的重要病原,對(duì)它們的研究具有重要意義。EB 病毒(Epstein-Barrvirus, EBV)屬于γ 皰疹病毒亞科, 基因組大小約172kb,包含近100 個(gè)基因, 編碼200 多種蛋白, 但大多數(shù)基因的功能還不清楚,。EBV 與多種人類(lèi)惡性腫瘤如Burkitt 氏淋巴瘤和在中國(guó)南方高發(fā)的鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma, NPC)相關(guān)[1],。為研究病毒基因功能, 對(duì)特定基因進(jìn)行修飾構(gòu)建病毒突變子具有重要價(jià)值, 但是由于皰疹病毒基因組大, 產(chǎn)生重組病毒一直是個(gè)難題。近年來(lái)把細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome, BAC)技術(shù)應(yīng)用于皰疹病毒的感染性克隆為皰疹病毒基因組學(xué)提供了重要的技術(shù)平臺(tái)[2,3],。BAC 中的F 因子使之能在大腸桿菌(Escherichia coli, E.coli)中的復(fù)制受到嚴(yán)格控制并保持低拷貝, 克隆至BAC 的皰疹病毒基因組隨著B(niǎo)AC 而復(fù)制, 在每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中保持1~2 個(gè)拷貝[4],。BAC-皰疹病毒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞產(chǎn)生病毒, 然后可以對(duì)它進(jìn)行表型研究。
為了研究與鼻咽癌相關(guān)的EBV 基因功能, 我們從Hammerschidit 研究組引入了最早報(bào)道的EBV-BAC基因組(p2089)[5], 在國(guó)內(nèi)首次建立了EBV 感染性克隆技術(shù)[6], 同時(shí), 還從鼻咽癌活檢組織中克隆了21 個(gè)EBV 癌蛋白LMP1 的全長(zhǎng)基因序列(GenBank 登錄號(hào)EF419184~EF419204),。要應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)一步研究基因功能, 關(guān)鍵的步驟之一是在EBV 基因組中引入突變?？寺≈罛AC 的EBV 基因組大, 不能直接使用常規(guī)的酶切和連接等克隆技術(shù)引入突變, 必須借鑒在大腸桿菌中操作BAC 載體的一些修飾方法如同源重組,。在BAC 操作技術(shù)中有2 種同源重組的方法比較常用。一種被稱(chēng)為“兩步法”, 由重組蛋白recA 介導(dǎo)重組[7],。這種方法需要1~3kb 的同源臂, 構(gòu)建穿梭質(zhì)粒的工作煩瑣, 而且效率低, 篩選重組體的過(guò)程也費(fèi)時(shí)費(fèi)力,。386 Jianhong Lu et al. /Acta Microbiologica Sinica (2008) 48(3)后來(lái)這個(gè)方法得到了一些改進(jìn)[8,9], 現(xiàn)在也仍被應(yīng)用到BAC-皰疹病毒的突變操作中。White 等[10]使用單獨(dú)表達(dá)的recA 質(zhì)粒, 精確地用綠色熒光蛋白(GFP)基因替換了BAC基因組中的標(biāo)記基因dsRed, 這種方法需要經(jīng)過(guò)共整合和兩次篩選工作, 優(yōu)點(diǎn)是沒(méi)有引入外源序列, 但兩端的同源區(qū)還是比較長(zhǎng), 分別為750bp 和480bp,。另一種方法為“一步法”, 也稱(chēng)ET克隆技術(shù)(由重組蛋白ET 介導(dǎo)的重組), 因介導(dǎo)重組的酶不同而具有不同的操作系統(tǒng)[11], 其中redαβγ 系統(tǒng)是效率比較高的一個(gè)系統(tǒng)[12],。ET 重組的優(yōu)點(diǎn)是重組的同源臂短(30~70bp)。本研究通過(guò)使用合適的內(nèi)切酶和方法改進(jìn)等, 使用一種BAC 技術(shù)即ET 重組, 簡(jiǎn)化了在EBV-BAC 中構(gòu)建突變體的工作, 減少了外源序列的引入, 并使該方法程序化,。這個(gè)方法也適應(yīng)于在EBV 其它基因和基于BAC 的其它皰疹病毒基因組中引入任意突變,。 本文將以在p2089 中用NPC 來(lái)源、包含LMP1 全長(zhǎng)編碼區(qū)的基因替代相應(yīng)區(qū)域?yàn)槔敿?xì)報(bào)道這種方法,。
基金項(xiàng)目: 中國(guó)博士后基金(20060390264); 湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(05JJ300064); 國(guó)家重大科學(xué)研究計(jì)劃(2006CB910504)
*通訊作者,。Tel/Fax: +86-731-4805383; E-mail: [email protected]
**作者簡(jiǎn)介: 兩位作者具有同等貢獻(xiàn)。盧建紅(1968. ), 女, 湖南醴陵人, 博士后, 研究員, 主要從事病毒分子生物學(xué)和腫瘤學(xué)研究, E-mail: jianhl@
sohu.com; 唐運(yùn)蓮(1968. ), 女, 湖南衡山人, 博士, 講師, 主要從事病理學(xué)和腫瘤學(xué)研究和教學(xué), E-mail: [email protected]
收稿日期: 2007-08-28; 修回日期: 2007-10-22
ISSN 0001-6209; CN11-1995/Q
全文下載：在基于BAC 的EB 病毒基因組中引入突變
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