Uli Schmidt*, Sandra Lubitz, Biljana Dumevska, Tomas Stojanov

Sydney IVF, Level 3 Kent St, Sydney, NSW 2000, Australia, *[email protected]

介紹

使用人類胚胎干細(xì)胞（ hesc ）進(jìn)行科學(xué)研究和臨床應(yīng)用需要嚴(yán)格的監(jiān)測細(xì)胞的屬性。這對于確定該細(xì)胞是否保留其多能性,，還是處于分化階段,，從而確認(rèn)干細(xì)胞的性質(zhì)非常重要。此外,，也需要有適當(dāng)?shù)姆治龇椒ㄓ糜跍y試和優(yōu)化hECS的培養(yǎng)和分化條件,。這些方法通常包括使用流式細(xì)胞儀分析生物標(biāo)志物的表達(dá)，以及用RT - PCR進(jìn)行基因表達(dá)的研究,。然而當(dāng)前,，高內(nèi)涵分析（ HCA）技術(shù)能夠較上述技術(shù)提供更多的研究優(yōu)勢，幫助研究者更好地定量研究hESCs的多能性與分化作用,。

細(xì)胞成像和數(shù)據(jù)分析

高內(nèi)涵分析通常包括自動對熒光標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行成像,，并在所獲得的圖像基礎(chǔ)上對細(xì)胞進(jìn)行計算和定量分析。對于人類胚胎干細(xì)胞研究面臨的一項特別的挑戰(zhàn)是其細(xì)胞形態(tài)較小,，且不斷呈高密度,，多層次的增長趨勢。這往往導(dǎo)致在個別單個細(xì)胞的特性,，如細(xì)胞核不能被軟件準(zhǔn)確識別和分割（圖1A）,。我們使用的HCA系統(tǒng)IN Cell Analyser 1000利用獨有的網(wǎng)格投影技術(shù)（ ' optigrid ' ） ，可用類似于激光共聚焦顯微鏡的方式消除不在聚焦平面上的熒光信號,。我們發(fā)現(xiàn),，使用細(xì)胞滲透遠(yuǎn)紅外熒光核染料DRAQ5 （ Biostatus ）和上述的光學(xué)共聚焦技術(shù)能夠大大提高圖像質(zhì)量和細(xì)胞識別準(zhǔn)確性（圖1B ）。然后,，我們對基于HCA分析hESC的方法進(jìn)行了優(yōu)化 ,。圖1 C顯示的即為一個典型的HCA的檢測方法。

圖1A: 普通熒光顯微鏡成像

圖1B: 使用IN Cell Analyser 1000的光學(xué)共聚焦技術(shù)成像

圖1C

- SIVF001 細(xì)胞使用微孔板培養(yǎng),，并使用DRAQ5 (細(xì)胞核)和轉(zhuǎn)錄因子Nanog的抗體標(biāo)記,。

- 細(xì)胞微孔板使用IN Cell Analyser 1000 （10x 物鏡，光學(xué)共聚焦模塊）成像,。

- 使用 IN Cell Developer 分析工作站分析DRAQ5標(biāo)記的細(xì)胞核相關(guān)參數(shù)，如DNA含量,，細(xì)胞核大小,、形狀等

- 在Nanog成像的熒光波長通道使用之前識別的細(xì)胞核區(qū)域，并且計算每個細(xì)胞核的平均熒光強度,。

- 細(xì)胞數(shù)據(jù)使用 Spotfire DecisionSite 進(jìn)行圖表可視化展示,。

干細(xì)胞的多能性和分化研究

我們經(jīng)常使用基于HCA的檢測方法干細(xì)胞系。我們通常使用免疫細(xì)胞化學(xué)分析的標(biāo)志物包括nanog, SSEA-4, Tra-1-60 和 Tra-1-81,。其中對于干細(xì)胞系SIVF001的分析結(jié)果在圖2A中概括顯示,。