研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)平臺
——酵母雙雜交系統(tǒng)的發(fā)展和應(yīng)用
隨著對多種重要生物的大規(guī)?；蚪M測序工作的完成,，基因工程領(lǐng)域又迎來了一個(gè)新的時(shí)代---功能基因組時(shí)代。它的任務(wù)就是對基因組中包含的全部基因的功能加以認(rèn)識,。生物體系的運(yùn)作與蛋白質(zhì)之間的互作密不可分,，例如：DNA合成、基因轉(zhuǎn)錄激活,、蛋白質(zhì)翻譯,、修飾和定位以及信息傳導(dǎo)等重要的生物過程均涉及到蛋白質(zhì)復(fù)合體的作用。能夠發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證在生物體中相互作用的蛋白質(zhì)與核酸,、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)是認(rèn)識它們生物學(xué)功能的第一步,。
酵母雙雜交技術(shù)作為發(fā)現(xiàn)和研究在活細(xì)胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用的技術(shù)平臺，在近幾年來得到了廣泛運(yùn)用,。酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進(jìn)行的,，研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對蛋白質(zhì)之間微弱的,、瞬間的作用也能夠通過報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測得到,，它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù),。大量的研究文獻(xiàn)表明,，酵母雙雜交技術(shù)既可以用來研究哺乳動物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作,，也可以用來研究高等植物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作。因此,，它在許多的研究領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用,。本文就酵母雙雜交的技術(shù)平臺和應(yīng)用加以介紹。
酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識,。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與,。反式轉(zhuǎn)錄激活因子，例如酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4在結(jié)構(gòu)上是組件式的（modular）,，往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上結(jié)構(gòu)上可以分開,，功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域（domain）構(gòu)成，其中有DNA結(jié)合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain,，DNA-AD）,。這兩個(gè)結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_時(shí)仍分別具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄,，只有當(dāng)被分開的兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí),，才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游啟動子,，使啟動子下游基因得到轉(zhuǎn)錄,。
根據(jù)這個(gè)特性，將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)Bait protein的基因構(gòu)建在同一個(gè)表達(dá)載體上,，在酵母中表達(dá)兩者的融合蛋白BD-Bait protein,。將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構(gòu)建在AD-LIBRARY表達(dá)載體上。同時(shí)將上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母,，這種改造后的酵母細(xì)胞的基因組中既不能產(chǎn)生GAL4,，又不能合成LEU、TRP,、HIS,、ADE，因此,，酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法正常生長,。當(dāng)上述兩種載體所表達(dá)的融合蛋白能夠相互作用時(shí)，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報(bào)告基因HIS,、ADE,、LACZ、MEL1,，從而通過功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落,。將陽性反應(yīng)的酵母菌株中的AD-LIBRARY載體提取分離出來，從而對載體中插入的文庫基因進(jìn)行測序和分析工作。在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上,，又發(fā)展出了
酵母單雜交,、酵母三雜交和酵母的反向雜交技術(shù)。它們被分別用于核酸和文庫蛋白之間的研究,、三種不同蛋白之間的互作研究和兩種蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)和位點(diǎn),。
基于酵母雙雜交技術(shù)平臺的特點(diǎn)，它已經(jīng)被應(yīng)用在許多研究工作當(dāng)中,。
1,、利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能
酵母雙雜交技術(shù)已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)新基因的主要途徑。當(dāng)我們將已知基因作為誘餌,，在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白,，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD-LIBRARY載體，并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機(jī)插入的cDNA片段,，并對該片段的編碼序列在GENEBANK中進(jìn)行比較,，研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。另外,，也可作為研究已知基因的新功能或多個(gè)篩選到的已知基因之間功能相關(guān)的主要方法,。例如：Engelender等人以神經(jīng)末端蛋白alpha-synuclein 蛋白為誘餌蛋白，利用酵母雙雜交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3為操作平臺,，從成人腦cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了與alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1,，并證明了Synphilin-1與alpha-synuclein 之間的相互作用與帕金森病的發(fā)病有密切相關(guān)。為了研究兩個(gè)蛋白之間的相互作用的結(jié)合位點(diǎn),，找到影響或抑制兩個(gè)蛋白相互作用的因素,，Michael等人又利用酵母雙雜交技術(shù)和基因修飾證明了alpha-synuclein的1-65個(gè)氨基酸殘基和Synphilin-1的349-555個(gè)氨基酸殘基之間是相互作用的位點(diǎn)。研究它們之間的相互作用位點(diǎn)有利于基因治療藥物的開發(fā),。
2,、利用酵母雙雜交在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用
利用酶聯(lián)免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技術(shù)都是利用抗原和抗體間的免疫反應(yīng),，可以研究抗原和抗體之間的相互作用,，但是，它們都是基于體外非細(xì)胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用,。而在細(xì)胞體內(nèi)的抗原和抗體的聚積反應(yīng)則可以通過酵母雙雜交進(jìn)行檢測,。例如：來源于矮牽牛的黃烷酮醇還原酶DFR與其抗體scFv的反應(yīng)中，抗體的單鏈的三個(gè)可變區(qū)A4,、G4,、H3與抗原之間作用有強(qiáng)弱的差異。Geert等利用酵母雙雜交技術(shù),，將DFR作為誘餌蛋白,，編碼抗體的三個(gè)可變區(qū)的基因分別被克隆在AD-LIBRARY載體上,，將BD-BAIT載體和每種AD-LIBRARY載體分別轉(zhuǎn)化改造后的酵母菌株中，并檢測報(bào)告基因在克隆的菌落中的表達(dá)活性,，從而在活細(xì)胞的水平上檢測抗原和抗體的免疫反應(yīng),。
3、利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥 物對蛋白質(zhì)之間相互作用的影響
酵母雙雜交的報(bào)告基因能否表達(dá)在于誘餌蛋白與靶蛋白之間的相互作用,。對于能夠引發(fā)疾病反應(yīng)的蛋白互作可以采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達(dá)到治療疾病的目的,。例如：Dengue病毒能引起黃熱病,、肝炎等疾病，研究發(fā)現(xiàn)它的病毒RNA復(fù)制與依賴于RNA的RNA聚合酶（NS5）與拓?fù)洚悩?gòu)酶NS3,，以及細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)受體BETA-importin的相互作用有關(guān),。研究人員通過酵母雙雜交技術(shù)找到了這些蛋白之間相互作用的氨基酸序列。如果能找到相應(yīng)的基因藥物阻斷這些蛋白之間的相互作用,，就可以阻止RNA病毒的復(fù)制,，從而達(dá)到治療這種疾病的目的。
4,、利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖（Genome Protein Linkage Map）
眾多的蛋白質(zhì)之間在許多重要的生命活動中都是彼此協(xié)調(diào)和控制的,。基因組中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系,。通過基因組的測序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基因和EST序列,，HUA等人利用酵母雙雜交技術(shù)，將所有已知基因和EST序列為誘餌,，在表達(dá)文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白,，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖,。對于認(rèn)識一些重要的生命活動：如信號傳導(dǎo),、代謝途徑等有重要意義。
參考文獻(xiàn)
Analysis of synphilin-1 and synuclein interactions by yeast two hybrid b-galactosidase liquid assay
Michael Neystata, et.al Neuroscience Letters 325 (2002) 119–123
Synphilin-1 associates with alpha-synuclein and promotes the formation of cytosolic inclusions
Engelender, S et.al. Nat. Genet., 22 (1999) 110–114.
Analysis of the interaction between single-chain variable fragments and their antigen in a reducing intracellular environment using the two-hybrid system
Geert De Jaeger,et.al. FEBS Letters 467 (2000) 316^320
Characterisation of inter- and intra-molecular interactions of the dengue virus RNA dependent RNA polymerase as potential drug targets
Subhash G.et.al. Farmaco 56 (2001) 33–36
Construction of a modular yeast two-hybrid cDNA library from human EST clones for the human genome protein linkage map
Shao-bing Hua, et.al. Gene 215 (1998) 143–152
Developing Yeast Hybrid System
ZHANG,et.al. Chinese Bulletin of Life Sciences 12(2000)34-36
Yeast two-hybrid system and its applications
ZHANG xiao-guang et.al Chinese Bulletin of Life Sciences 13(2001)228-231
