以下是我做高效感受態(tài)的方法,，參照90年Inoue法,，本人將其修改為
A液：1M，MnCl2：
B液：1M,，HEPES,，pH=6.2-6.8，用無(wú)菌水配,，配后不需滅菌,；
C液 稱取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g,，全部轉(zhuǎn)入細(xì)口試劑瓶,，然后加入46ml三蒸水，輕輕振蕩使所有組分充分溶解,。將瓶塞蓋上并用牛皮紙,、棉線包扎，然后放入滅菌鍋121℃高壓滅菌備用,。
取1管B液（0.6ml）,，全部加入C液(46ml)中，混勻后，再用1ml移液器加入3.3ml A液,，混勻冰浴即可使用,。
劃線得到單菌落,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約17小時(shí)， 挑取2-4個(gè)形態(tài)飽滿的單菌落接種于裝有100ml SOB 培養(yǎng)基的三角瓶,37℃劇烈振蕩（300 rpms）培養(yǎng)3-4小時(shí), 將培養(yǎng)溫度調(diào)至18℃劇烈振蕩（3280 rpms）培養(yǎng),，其余與普通感受態(tài)差不多,，每管加入4ml TB緩沖液，輕輕振蕩,，使菌體重新懸浮,，加入280ml DMSO（可用國(guó)產(chǎn)分析純），混勻后分裝入1.5ml EP管,，冰上靜置15分鐘,。用紗布將所有裝有感受態(tài)的EP管包好，用棉線系好后放入液氮中速凍,，在液氮中靜置12小時(shí)以上,。取出感受態(tài)放入-70℃超低溫冰箱備用。
效率非常高,，一般可到10*8,，好時(shí)可到10*9，特別適宜于大片段與文庫(kù)構(gòu)建及珍貴材料的連接轉(zhuǎn)化,。

潔凈是最重要的,。無(wú)菌都無(wú)所謂，在操作臺(tái)上可正常操作,。離心力要注意不要超過(guò)2500g,建議1500-2000g 5min,。涂板要注意，不要覺(jué)得不勻而多次反復(fù),，輕輕在平板上帶一下感覺(jué)板上大部分地方走過(guò)即可,，特別在冰箱中保存過(guò)或在溫箱中溫浴2小時(shí)以上的板。涂完后建議空氣晾干（20-30分鐘）這樣會(huì)減少衛(wèi)星菌落出現(xiàn),。

預(yù)冷是必要的,。整個(gè)過(guò)程的低溫也并非特別重要，只要注意就行了,，我在去殘液時(shí)經(jīng)常在室溫倒置1min,，對(duì)感受態(tài)效率提高有幫助，第一次多加一點(diǎn)緩沖液,，我經(jīng)常加至20ml，效果不錯(cuò),。

關(guān)于大腸桿菌的感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化的方法很多,，最復(fù)雜的莫過(guò)于電轉(zhuǎn)化，而最簡(jiǎn)單的則是將LB平板上的菌落直接挑入裝有緩沖液的EP管冰箱即開(kāi)始轉(zhuǎn)化。對(duì)于做克隆工作的人而言,，高而穩(wěn)定的感受態(tài)可減輕不少麻煩,。
現(xiàn)在大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率最高的要數(shù)電轉(zhuǎn)化，可達(dá)到1010,，但是操作起來(lái)比較麻煩,。要想又簡(jiǎn)單，又能有較高的轉(zhuǎn)化效率,，最好的莫過(guò)于1990年《gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化方法,。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況，我們將其稍作修改,，做成了GLP文件,，但其中仍有許多可改進(jìn)或需要注意的地方，其中有一些對(duì)普通感受態(tài)效率的提高也有一定的幫助,。
1,、所用器具的潔凈程度。這一點(diǎn)非常重要,，是所有與感受態(tài)有關(guān)的方法與文章上必講的,，毋庸置疑。
2,、培養(yǎng)基的裝量：培養(yǎng)基的裝量是很重要的,，這關(guān)系到菌體生長(zhǎng)過(guò)程中的能量代謝問(wèn)題，是有氧還是無(wú)氧生長(zhǎng),。厭氧生長(zhǎng)出來(lái)的菌體是做不出效率高的感受態(tài)的,。建議裝量不要高于此值為：培養(yǎng)基體積/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml,。
3,、培養(yǎng)基的pH值。這是講的pH值并非單指配置或滅菌后的pH值,，而且還包括整個(gè)搖瓶結(jié)束后的pH值,。一般來(lái)說(shuō)，接種前的pH值在6.8-7.2,，等菌搖好后,，可以測(cè)一下pH值，不要低于6.0,，最好在6.5以上,。這表示菌體的代謝為有氧代謝，生長(zhǎng)狀態(tài)良好,，按要求做,，肯定效率不低,。
4、培養(yǎng)后的OD值,。其實(shí)這并一個(gè)非常重要的參數(shù),，只是當(dāng)OD值大到一定的程度后，菌體要保持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)已經(jīng)不太可能,，因此很多指導(dǎo)方法上強(qiáng)調(diào)OD不得大于0.6,，0.8等等。同時(shí),，OD值大時(shí)菌體總量大,，因而感受態(tài)絕對(duì)數(shù)量要大一點(diǎn)，因而需要在OD值的兩方面影響中找一個(gè)平衡點(diǎn),。
5,、培養(yǎng)基中的各種離子。經(jīng)驗(yàn)證明,，當(dāng)培養(yǎng)基中存在一定量的Mg2+離子時(shí),，該方法制得的感受態(tài)要相對(duì)較高。在制備普通感受時(shí),，使用20mM MgCl2做為培養(yǎng)基的添加物,，在感受態(tài)收獲之前20-30分鐘加入，會(huì)收到很好的效果,。
6,、培養(yǎng)溫度。文獻(xiàn)及經(jīng)驗(yàn)告訴我們,，較低的溫度培養(yǎng)有利于感受態(tài)的形成,，這樣可以獲得較高的感受態(tài)，但太低又不實(shí)用,，因而產(chǎn)生了Inoue的高效感受態(tài)制備方法,，它實(shí)際是利用了所有有利于感受態(tài)的文獻(xiàn)而得出的一個(gè)非常理想方法。
7,、此外文獻(xiàn)報(bào)道,，在保存感受態(tài)時(shí)，DMSO要比甘油的效果要好,，它會(huì)使感受態(tài)的效率增加,。
8、液氮速凍也會(huì)使感受態(tài)的效率提高,，因此推薦用液氮速凍感受態(tài),，然后保存于超低溫冰箱內(nèi)。至于在液氮中保存12小時(shí)以后再轉(zhuǎn)入超低溫冰箱,，這點(diǎn)未做實(shí)驗(yàn),，只是一種感覺(jué),，第一次這樣做了，沒(méi)問(wèn)題,，以后就照此辦理而已。