近年來,，動物克隆技術(shù)飛速發(fā)展,，其成果令人矚目，已先后取得了小鼠,、綿羊、牛,、兔,、豬、山羊等哺乳動物胚胎細(xì)胞克隆的成功,，并相繼獲得綿羊,、小鼠、牛,、山羊等哺乳動物體細(xì)胞克隆后代,。

克隆豬技術(shù)
               
            目前，生產(chǎn)克隆豬主要有3種不同方法,。第一種方法是胚胎分割,。利用胚胎分割技術(shù)將動物早期胚胎一分為二，甚至一分為四或八,，以獲得同卵雙生或同卵多生后代,。迄今為止，通過胚胎分割已獲得了從2細(xì)胞到擴張孵化胚泡各發(fā)育階段的同卵雙生后代,。利用該技術(shù)已成功獲得小鼠,、山羊、綿羊、牛,、馬和豬的同卵雙生后代,，還獲得了同卵三生(牛)和同卵同生(綿羊)后代。但此法得到的分割胚胎有限,，生產(chǎn)克隆豬時應(yīng)用得較少,。
               
            第二種方法是利用胚胎干細(xì)胞（ES)形成的生殖系嵌合體生產(chǎn)克隆后代。胚細(xì)胞具有多能性,，當(dāng)被導(dǎo)入早期胚胎后可形成嵌合體,，然后篩選出生殖系嵌合體并進(jìn)行交配便可得到克隆后代。在小鼠上ES細(xì)胞和基因打靶技術(shù)已成為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的常規(guī)方法,。豬ES細(xì)胞分離成功的報道很少,，只建立了豬類ES細(xì)胞系，因此利用生殖嵌合體生產(chǎn)克隆豬受到限制,，隨著豬ES細(xì)胞分離成功,，該技術(shù)可望在豬克隆上得到廣泛應(yīng)用。
               
            第三種方法是核移植技術(shù),。當(dāng)前,，克隆豬大多采用此法。通過移植技術(shù)已相繼成功地獲得了小鼠,、綿羊,、家兔、豬和山羊的克隆后代,，?？寺∨叩闹貜?fù)克隆已獲得了第六代克隆胚和經(jīng)三代克隆犢牛。山羊胚胎細(xì)胞核移植胚的再克隆也已成功,。Campbell等(1996)誘導(dǎo)胚胎細(xì)胞系中分化程度比ES細(xì)胞更高的上皮細(xì)胞退出正常的細(xì)胞分裂周期而進(jìn)入靜止期(G0期),，然后移入核受體，最終獲得成活羔羊,。Wilmut等(l997)利用成年綿羊乳腺上皮細(xì)胞成功地進(jìn)行下體細(xì)胞克隆,，獲得克隆后代多利。到目前為止,，利用核移植技術(shù)生產(chǎn)克隆動物的核供體細(xì)胞主要有3種:胚胎細(xì)胞,、胎兒成纖維細(xì)胞和體細(xì)胞。后兩者來源廣泛,，培養(yǎng)較容易,，但并不適于同源重組，而同源重組又是生產(chǎn)基因敲除動物所必需的,。相反胚胎細(xì)胞更接近于ES細(xì)胞,，可進(jìn)行同源重組,，并可建立細(xì)胞系?？寺游飼r需要大量成熟卵母細(xì)胞及胚,。因此有必要獲得大量未成熟卵母細(xì)胞并通過建立體外成熟、體外受精和體外培養(yǎng)系統(tǒng)來滿足需要,。核供體細(xì)胞經(jīng)體外擴增后被移入去核卵母細(xì)胞構(gòu)成重組胚,，這些重組胚移植入假孕母豬體內(nèi)妊娠直至分娩。

PPL公司的5只可隆豬：Noel, Angel, Star, Joy and Mary

具體研究進(jìn)展

        有關(guān)克隆豬的專題報告中一般采用將未分化的早期胚胎細(xì)胞(4細(xì)胞的卵母細(xì)胞胚)作為供核細(xì)胞 與去核卵母細(xì)胞融合,經(jīng)表型選擇后進(jìn)行的豬克隆繁殖,，在內(nèi)品生產(chǎn)中具有潛在的重要意義,。另外，基因修飾技術(shù)與克隆技術(shù)的結(jié)合能為人類創(chuàng)建外源性移植器官的潛在供體,。

        在眾多有關(guān)家畜克隆的報道中均以胎兒成纖維細(xì)胞作為供核細(xì)胞,，究其原因是這些細(xì)胞能在克隆前進(jìn)行基因修飾。 因此,，我們對豬胎兒成纖維細(xì)胞在核移植后繼續(xù)發(fā)育的能力進(jìn)行了評估,。將“梅山×梅山( 黑毛)”豬在妊娠24d時屠殺取其胎兒，經(jīng)胰蛋白酶作用后建立原代細(xì)胞培養(yǎng),。再將細(xì)胞進(jìn)行高密度平板培養(yǎng)傳代2至6次,，最后進(jìn)行融合；在不補充培養(yǎng)基的情況下連續(xù)培養(yǎng)l6d,，產(chǎn)生的細(xì)胞處在G0期,，最后用PCR方法鑒定每個胚胎的性別。由于與它們的成纖維細(xì)胞抗原性一致,，經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞對細(xì)胞角蛋白和階段特異性Ⅰ型胚胎抗原呈陰性反應(yīng),，但是對中胚層的標(biāo)記波形蛋白呈強陽性。

        由成年體細(xì)胞克隆的小鼠系采用特殊的非融合方法,，即通過電壓驅(qū)動微注射方法選擇性地將供體核導(dǎo)入去核卵母細(xì)胞，我們將該方法應(yīng)用于豬的 細(xì)胞核移植中,。在含有細(xì)胞松弛素的NCSU23培養(yǎng)基中,，采用電壓驅(qū)動微注射方法將取自長白小母豬或黑白花小母豬(長白×杜洛克)卵母細(xì)胞中的中期Ⅱ型染色體和第一極體除去，通過電壓驅(qū)動微注射將“梅山×梅山(黑毛)”雜交豬的胎兒成纖維細(xì)胞核單個導(dǎo)入每個去核卵母細(xì)胞,。重新生成的胚前體在38℃孵化3～4h,，然后用脈沖電激活，最后再對所獲得的 核移植胚胎進(jìn)行培養(yǎng),。

　　雖然豬胚胎能在體外很好地發(fā)育至胚泡階段,，但移植到代孕母豬的子宮角后，生長發(fā)育情況卻很差,。由于要確保母豬能正常妊娠一般至少需要4個胎兒,，據(jù)此推斷如果子宮內(nèi)存 在經(jīng)受精產(chǎn)生的輔助胚胎，會有助于克隆胚胎的完全發(fā)育。

　    為了研究輔助胚胎在子宮內(nèi)促進(jìn)克隆胚胎發(fā)育的能力,，設(shè)計了2個試驗,，克隆胚胎在試驗Ⅰ中經(jīng)體外培養(yǎng)20h(單細(xì)胞  胚胎)或在試驗Ⅱ中經(jīng)體外培養(yǎng)40h(2-4細(xì)胞的胚胎)后，移植到代孕母豬子宮中,，所有分娩的后裔仔豬(試驗Ⅰ的9只仔豬和系列試驗Ⅱ的24只仔豬)全為白色,，因此，可以證明這些仔豬為非克隆豬,?？寺∨咛o法完成4胎的妊娠全過程的事實表明，核移植胚胎和輔助胚胎間的比例是相當(dāng)重要的,，本次試驗中2種胚胎比例顯然不是處在最佳程度,。

　　試驗Ⅲ將在2-8細(xì)胞階段間進(jìn)行核移植的11O個克隆胚胎經(jīng)成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基傳代2至6代后，移植到4只  不含輔助授精胚胎的代孕母豬子宮中,其中3只代孕母豬分別在胚胎移植后的27d,、35d和6ld  開始發(fā)情,，豬的發(fā)情周期為2ld，發(fā)情延遲表明每只代孕母豬已經(jīng)妊娠,。由于豬胚胎在子宮壁著床發(fā)生于胚胎發(fā)育的13d至l4d,，所以很可能其中2只妊娠母豬在胎盤形成后就終止胚胎發(fā)育，胚胎終止發(fā)育的原因不明,。

　　在第3個試驗中,，第4只代孕母豬在接受36個克隆胚  胎的輸卵管移植后仍繼續(xù)妊娠，而這些克隆胚胎是在成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中傳代至第2代時被取出移植的,。其中一個克隆胚胎發(fā)育到足月,，于2000年7月2日自然分娩，所產(chǎn)仔豬取名Xena,，初生體重1.2kg,，胎盤重0.3kg，兩者均處于非克隆仔豬的正常值范圍內(nèi),。仔豬胎盤經(jīng)解剖觀察表明正常,，而有些克隆牛的胎盤畸形，采用核微注射技術(shù)的克隆小鼠,，其胎盤始終比非克隆小鼠的大得多,。

　　Xena克隆豬體質(zhì)健康、雌性,、黑毛色,，與“梅山×梅山  ”核供體母體的預(yù)測結(jié)果相符。為了確證這一結(jié)果,，從與Xena克隆豬有關(guān)的3個相關(guān)體  (Xena,、長白代孕母豬,、培基的成纖維細(xì)胞中提取DNA，設(shè)23個標(biāo)識組,，進(jìn)行特異性微衛(wèi)星標(biāo)記分析,。這些分析是在另外的實驗室里進(jìn)行的，因而不帶有任何主觀色彩,。分析結(jié)果證實Xena克隆豬的基因組與梅山豬供核威纖維細(xì)胞的基因組屬同一種類,，與長白代字  母豬的基因組有明顯的區(qū)別。

　　上述研究結(jié)果表明,，采用微注射技術(shù)將體細(xì)胞核移植到去核卵母細(xì)胞能成功克隆出豬,。雖然還沒搞清全部機理，但推測部分原因是由于微型吸管  的電壓激活時操作快速所致;此外,，豬克隆的成敗可能與供核細(xì)胞的胞質(zhì)染色體污染敏感度有關(guān),，相對融合(細(xì)胞移植，而言,，微注射方法更有利核移植的進(jìn)行,。與融合不同，微注射  可選擇性地去除大部分供核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),，因而相對而言胞質(zhì)的含量在胚胎早期是稀薄的,。

研究意義
               
        利用克隆技術(shù)可以極大地加快豬育種進(jìn)程，大大縮短育種年限,，在較短時間內(nèi)獲得大量遺傳同質(zhì)的優(yōu)秀后代,，顯著提高育種效率。豬克隆技術(shù)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合可為人類生產(chǎn)大量的珍貴生物制品,，并在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也有誘人的應(yīng)用前景,。這種技術(shù)除了可以生產(chǎn)各種醫(yī)用人體蛋白外，對人類的細(xì)胞和組織治療也大有好處,。用此技術(shù)可以生產(chǎn)基因敲除動物,，從其身上可以獲得不含人特定抗原基因的組織器官，以用于異種移植,，解決人類移植器官供求矛盾,，促進(jìn)人類疾病的治療。而這一點正是克隆豬較其它克隆物種所具有的獨特優(yōu)點,。

問題與不足
               
        豬克隆雖然意義深遠(yuǎn),，但其研究進(jìn)展相對緩慢,，相關(guān)技術(shù)日前還很不完善,。體外成熟、體外受精及體外培養(yǎng)系統(tǒng)還很不成熟,，細(xì)胞核的分離和卵母細(xì)胞的去核水平也需提高,。深層次的原因是相關(guān)基礎(chǔ)理論研究十分薄弱,，缺乏對一些早期胚胎發(fā)生機理的深入了解，基因組重新編程的機制尚不清楚,，基因印跡對核移植后基因組重新編程的影響也有待進(jìn)一步闡明,。總之,，今后如能克服目前所遇到的各種困難,，豬克隆技術(shù)將得到進(jìn)一步完善和發(fā)展，其中基礎(chǔ)研究及生產(chǎn)實踐方面的應(yīng)用也會更加廣泛,。