miRNAs世界更新不斷，最近來自約翰霍普金斯和霍德華休斯醫(yī)學(xué)院的Victor Velculescu of the Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center的研究人員利用一種新型分析技術(shù)——miRAGE對人類microRNAs進行了至今為止最大量的分析，發(fā)現(xiàn)了133個新miRNAs,，這幾乎增加了實驗驗證的miRNAs數(shù)量的一半,。這一為研究人員提供了重要研究線索的發(fā)現(xiàn)刊登在2月27日PNAS網(wǎng)絡(luò)版上,。
MicroRNA,，即miRNA ,，是一種21－25nt長的單鏈小分子RNA,。它廣泛存在于真核生物中,，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA。miRNA在從癌癥,、心臟病到艾滋病的各種疾病中起到一定的作用,，而且有間接的證據(jù)表明如果將兩個miRNA從人類基因組中刪除就會發(fā)生白血病。據(jù)推測MiRNA能夠調(diào)節(jié)人類的三分之一的基因,。
這一受矚目的小分子雖然掀起了研究熱潮,，但是miRNAs神秘面紗仍然未被揭開，這主要是因為研究人員只能對已知的200多種miRNAs進行功能分析,，而且不像大RNA分子mRNA,，miRNA調(diào)節(jié)基因功能主要是通過干擾遺傳信息的傳遞。為了解決這個問題,，Jordan Cummins等人嘗試了一種新的分析技術(shù)：miRNA基因表達系列分析（miRNA serial analysis of gene expression,，miRAGE），這種技術(shù)主要就是從細胞中分離出很多小RNA分子,，然后逆轉(zhuǎn)錄成DNA,，串聯(lián)成長鏈進行測序。之后研究人員計算機分析這些DNA序列,，識別那些帶有基因特征的miRNAs（比如說能形成識別Dicer酶的發(fā)夾結(jié)構(gòu)）,。利用這一技術(shù)，研究人員發(fā)現(xiàn)了133個miRNAs,，以及112個之前未得以辨認的miRNA“star forms”（miRNAs功能單鏈的互補鏈,，目前已知的star forms很少）。
miRNAs研究至今依然是科研人員的寵兒,，然而隨著研究的加深,，miRNA這個寶藏還有很多璀璨的寶物未被挖掘出來，要想挖到這些寶物還需要挖得更勤更深,。
原始出處：
Cummins JM, He Y, Leary RJ, Pagliarini R, Diaz LA Jr, Sjoblom T, Barad O, Bentwich Z, Szafranska AE, Labourier E, Raymond CK, Roberts BS, Juhl H, Kinzler KW, Vogelstein B, Velculescu VE.The colorectal microRNAome.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Feb 27
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什么是miRNA
MicroRNAs (miRNAs)是一種大小約21—23個堿基的單鏈小分子RNA,，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成,，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關(guān)。據(jù)推測,，這些非編碼小分子RNA（miRNAs）參與調(diào)控基因表達,，但其機制區(qū)別于siRNA介導(dǎo)的mRNA降解。第一個被確認的miRNA是在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4 和let-7,，隨后多個研究小組在包括人類,、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百個miRNAs,。
miRNA 的特征
已經(jīng)被鑒定的miRNAs據(jù)推測大都是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu),、約70個堿基大小形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成的，有5’端磷酸基和3’羥基,，大小約21—25nt的小分子RNA片斷,，定位于RNA前體的3’端或者5’端。
最近3個研究小組分別從線蟲,、果蠅和Hela細胞中鑒定的100個新miRNAs中,，有15%跨越線蟲、果蠅和哺乳動物基因組具有高度的保守性（只有有1—2個堿基的區(qū)別）,，Lau 和Bartel 實驗室的同事更加認為：所有的miRNAs可能在其他物種中具有直向同源物（Ortholog,，指那些起源于同一祖先，在不同生物體中行使同一功能的基因群就可比作為一個門類,，這些類似的基因被稱為“直向同源物”）,。
Bantam 最早被認為是果蠅中參與細胞增殖的一個基因位點。已知幾個包含增強子的轉(zhuǎn)座子插入跨越這個位點的一段12.3kb區(qū)域會導(dǎo)致果蠅的眼和翅重復(fù)生長,，而由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的一段跨越該位點的23kb片斷缺失則導(dǎo)致突變果蠅個體小于野生型果蠅,。Cohen和同事用一段3.85kb的片斷導(dǎo)入21kb片斷缺失的果蠅中使其恢復(fù)原來的大小。但是奇怪的是表達這個3.85kb片斷中的EST卻沒有同樣的效果,。Cohen將這個片斷和瘧蚊Anopheles gambiae的同源序列進行比較,，發(fā)現(xiàn)一段90bp的高度保守區(qū)，經(jīng)過RNA folding program (mfold)發(fā)現(xiàn)這個保守序列可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),，使得這個區(qū)段很象是一個miRNA的前體,。這個結(jié)果經(jīng)過Northern blot證實突變果蠅的幼體缺少一個21bp的bantam miRNA ，用這個90bp的mRNA前體經(jīng)過一系列的“功能缺失”—“功能恢復(fù)”實驗,，證實 bantam miRNA在細胞增殖中的作用,。研究人員用計算機程序檢索在hid mRNA的3’非編碼區(qū)找到了bantam的3個潛在的結(jié)合位點（ hid是果蠅中一個誘導(dǎo)凋亡的基因），并證實 bantam miRNA抑制hid 的翻譯而非轉(zhuǎn)錄,。
miRNAs的表達方式各不相同,。部分線蟲和果蠅的miRNA在各個發(fā)育階段的全部細胞中都有表達，而其他的miRNA則依據(jù)某種更為嚴(yán)謹?shù)奈幌嗪蜁r相的表達模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern）——在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異,。
miRNA的功能
對microRNAs (miRNAs)的研究正在不斷增加,，原因是科學(xué)家開始認識到這些普遍存在的小分子在真核基因表達調(diào)控中有著廣泛的作用。在線蟲,，果蠅,，小鼠和人等物種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的數(shù)百個miRNAs中的多數(shù)具有和其他參與調(diào)控基因表達的分子一樣的特征——在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異,，這種miRNAs表達模式具有分化的位相性和時序性（ differential spatial and temporal expression patterns）,，提示miRNAs有可能作為參與調(diào)控基因表達的分子，因而具有重要意義,。
第一個被確認的miRNA——在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4 和let-7,，可以通過部分互補結(jié)合到目的mRNA靶的3’非編碼區(qū)(3’UTRs)，以一種未知方式誘發(fā)蛋白質(zhì)翻譯抑制,，進而抑制蛋白質(zhì)合成，通過調(diào)控一組關(guān)鍵mRNAs的翻譯從而調(diào)控線蟲發(fā)育進程(reviewed in Pasquinelli 2002),。
bantam miRNA是第一個被發(fā)現(xiàn)有原癌基因作用的miRNA,。除了lin-4、let-7,，已知還有一些miRNAs可能參與在細胞分化和組織發(fā)育過程中起重要作用的基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,，例如mir-14、mir-23 等,。
在植物miRNAs的研究中有兩條線索提示miRNAs可能參與植物的發(fā)育過程,。一是在carpel factory (car) 突變株中3個miRNAs的表達水平顯著下降。CARPEL FACTORY 是一個類似Dicer的酶,，參與植物的發(fā)育,，其缺失突變株表現(xiàn)為胚胎和葉片發(fā)育的缺陷。實驗結(jié)果提示這種缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的,。多數(shù)的植物miRNAs在某些特定組織中高水平表達也提示他們可能參與了植物組織的發(fā)育,。
對一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs參與生命過程中一系列的重要進程，包括早期發(fā)育(Reinhart 2000),，細胞增殖,，細胞凋亡，細胞死亡(Brennecke 2003）,，脂肪代謝（Xu 2003)和細胞分化(Kawasaki 2003),。此外，一個研究表明,，2個miRNAs水平的下降和慢性淋巴細胞白血病之間的顯著相關(guān),，提示miRNAs和癌癥之間可能有潛在的關(guān)系(Calin 2002)。
由于miRNAs存在的廣泛性和多樣性，提示miRNAs可能有非常廣泛多樣的生物功能,。盡管對miRNA的研究還處于初級階段,，據(jù)推測miRNAs在高級真核生物體內(nèi)對基因表達的調(diào)控作用可能和轉(zhuǎn)錄因子一樣重要。有一種看法是：miRNAs可能代表在一個新發(fā)現(xiàn)的層次上的基因表達調(diào)控方式,。
然而,，大多數(shù)miRNAs的功能仍然是個謎。
miRNA的作用方式
最早被發(fā)現(xiàn)的兩個miRNAs——lin-4 and let-7被認為是通過不完全互補結(jié)合到目標(biāo)靶mRNA 3’非編碼區(qū)端,，以一種未知方式誘發(fā)蛋白質(zhì)翻譯抑制,，進而抑制蛋白質(zhì)合成，阻斷mRNA的翻譯,。多個果蠅miRNAs也被發(fā)現(xiàn)和他們的目標(biāo)靶mRNAs的3’非編碼區(qū)有部分同源,。由于miRNAs和其潛在的目標(biāo)靶之間并非完全互補，這使得通過信息學(xué)的方法鑒定miRNA的目標(biāo)靶位點變得困難,。因而也無法確定miRNAs的作用方式是什么,，以何種機制影響mRNA的翻譯，以何種方式調(diào)控基因表達,。miRNAs的作用目標(biāo)靶和活性機制一直是各地的研究人員的關(guān)注熱點,。
在植物中目前有一個miRNA和3個潛在的目標(biāo)靶基因完全互補（這些scarecrow 基因編碼潛在的轉(zhuǎn)錄因子），盡管目前還不清楚這些基因是否就是miRNA的目標(biāo)靶,，這仍是第一次發(fā)現(xiàn)miRNA 和其潛在的目標(biāo)靶完全互補,，也提示miRNA可能包含和siRNA類似的作用方式。
識別 miRNAs的方法
多個研究小組采用生物化學(xué)結(jié)合是生物信息學(xué)的方法開展對miRNAs的研究工作,。由于據(jù)推測都是由Dicer酶降解RNA得到的,，21—23個堿基大小、有5’端磷酸基和3’羥基的RNA片斷,，有的實驗室采用改良的定向克隆方法來篩選具有相同特征的小分子——篩選一定大小的RNA分子,，連接到3’和5’的適配子（adapters），逆轉(zhuǎn)錄并通過PCR擴增,、亞克隆并測序,。miRNA前體在基因組上的定位和聚類是通過向基因組數(shù)據(jù)庫查詢進行。這個方法有助于判斷miRNAs是否是mRNAs,、tRNAs,、rRNAs等分子的降解產(chǎn)物。
有的實驗室通過一種RNA folding program ’mfold’ 來判斷C. elegans 和C. briggsae 之間的高度保守區(qū)域是否含有潛在的miRNA前體,，然后用Northern Blots的方法來確定這些miRNAs是否真的表達了,。
盡管有數(shù)百個miRNAs通過生化或者是生物信息學(xué)的方法被鑒別出來，已經(jīng)鑒別出來的miRNAs只不過是滄海一粟,，由于很多已經(jīng)鑒別出來的miRNAs是從單個克隆中鑒別出來的,，所以可以假設(shè)還有很多miRNAs在分離和鑒定過程中被“漏掉”了，測序工作還遠遠不夠。
miRNA和siRNA的關(guān)系
miRNA和siRNA之間的關(guān)系令人迷惑,。從表面上說,，一個是非編碼的單鏈小分子RNA，在進化上高度保守,，通過翻譯抑制調(diào)控基因表達而不影響轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性,；另一個是針對編碼區(qū)的雙鏈小分子RNA，每個轉(zhuǎn)錄本都可能有很多個siRNAs,，是通過降解目標(biāo)靶,，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達。由于每個mRNA模版可能產(chǎn)生很多個siRNAs,，要給每個siRNA定一個基因的名字就很困難,。miRNA是進化進程中高度保守的，因此給直向同源物一個同樣的名字可能有助于了解他們的功能,，而給另一個物種中一段無關(guān)的序列一個同樣的名字就容易造成混亂,。
然而，據(jù)推測miRNAs通常是由較大的（7090 nt）的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（發(fā)夾結(jié)構(gòu)）前體經(jīng)Dicer酶切割得到的,，而Dicer同樣負責(zé)將長雙鏈RNA切割為siRNA,，而且二者的長度也差不多，同樣有調(diào)控基因表達功能,。因而這兩類小分子RNA之間的關(guān)系格外令人關(guān)注。
兩個廣為人知的miRNA——在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4 和let-7,，可以通過部分互補結(jié)合到目的mRNA靶的3’非編碼區(qū)(3’UTRs),，通過一種未知方式誘發(fā)蛋白質(zhì)翻譯抑制從而抑制蛋白質(zhì)合成。這種結(jié)合并不誘導(dǎo)mRNA靶的降解,，就是說作為翻譯抑制子本身不影響對應(yīng)mRNA的豐度,，其原因據(jù)推測是由于miRNA和結(jié)合位點之間不完全互補。這就區(qū)別于siRNA的介導(dǎo)的mRNA的降解,。但是其他一些miRNAs可能以類似siRNA的方式介導(dǎo)目的RNA的降解,。實驗表明引入和let-7目的mRNA靶完全互補的miRNA會誘導(dǎo)mRNA靶的降解。還有實驗結(jié)果表明一些miRNA,，包括在植物中發(fā)現(xiàn)的Scarecrow miRNA,，能結(jié)合完全互補的mRNA鏈從而降解mRNA序列，抑制蛋白合成,。這提示miRNAs可以和siRNAs一樣作用,，這兩種小分子RNA作用通路可能有重疊的部分。這種重疊同樣提示siRNAs可能也有和miRNAs同樣的功能,。
一個很有趣的實驗證實這個觀點：Doench和同事挑選一個已知在體內(nèi)可以有效使CXCR4基因沉默的siRNA,，然后在熒光素酶報告基因的3’端插入對應(yīng)的CXCR4結(jié)合位點——其中一個拷貝是插入一個完全匹配的CXCR4結(jié)合位點，另一個拷貝插入4個只有3’和5’端匹配，而中間不同的CXCR4結(jié)合位點,，這樣選定的siRNA就不能完全結(jié)合到這個結(jié)合位點——中間形成一個突起的不匹配的環(huán),。將這兩個拷貝轉(zhuǎn)入Hela細胞并用siRNA誘導(dǎo)基因沉默。結(jié)果很有趣——兩個實驗都錄得熒光素酶活性下降了超過10倍,，RT-PCR和Northern分析證實,，第一個實驗的熒光素酶轉(zhuǎn)錄本下降了超過10倍，這正是正常的siRNA介導(dǎo)的RNAi反應(yīng),，目標(biāo)靶mRNA降解導(dǎo)致表達水平的下降,，而第二個實驗中熒光素酶轉(zhuǎn)錄本僅僅下降1.2倍，這種目的基因表達水平下看起來象源于miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制降,，而不是siRNA介導(dǎo)的影響mRNA的穩(wěn)定性導(dǎo)致,。實驗表明：siRNA可能以miRNA的方式作用于mRNA。實驗人員還進行了另一個實驗：改變第二個實驗中的不匹配環(huán)的堿基序列看起來不影響抑制效果,，但是siRNA和報告基因上的結(jié)合位點的匹配程度越高抑制效果越好,，增加siRNA的量，抑制效果越好——這一點和siRNA抑制的情況一樣——唯一不同的是：完全匹配的結(jié)合位點（siRNA作用方式）可以單獨起作用而相互不影響,，而增加不完全配對的結(jié)合位點（注意在第二個實驗中用了4個CXCR4結(jié)合位點）的個數(shù)對翻譯抑制有顯著的加乘作用,。
在哺乳動物細胞中還沒有找到內(nèi)源的siRNA，外源的siRNA介導(dǎo)的RNAi作用正是一種抵御機制,。而miRNAs則廣泛存在于哺乳動物細胞中,，從理論上推測可能參與多種調(diào)控作用。這兩種小東西的作用機制和相互關(guān)系的本質(zhì)就顯得更加撲朔迷離,。如何在實驗中正確鑒定siRNA和miRNA,，甚至是其他的小分子RNA都成為一個值得關(guān)注的問題。
