動物模型是研究人員了解生物體發(fā)育、病理機制以及藥物研制等方面的一種強有力的工具,。來自第三軍醫(yī)大學的“長江學者”李林教授的研究組成功構(gòu)建了RNAi轉(zhuǎn)基因小鼠模型。
 
    為了研究骨形成蛋白4(Bone morphogenetic protein 4, BMP4)在骨骼發(fā)育中的作用,，研究組以含有pLoxPneo基因的pBSK/U6載體為骨架,，首先構(gòu)建小鼠BMP4條件性RNAi(conditional RNA interference)載體――BMP4CRNAi，然后利用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Afl III獲取目的干擾片段并利用純化后的含neo基因的片段對FVB小鼠超排獲取的0.5天的受精卵進行顯微注射,。
 
    研究組利用PCR對G0代小鼠進行鑒定篩選,，PCR陽性小鼠再與FVB小鼠交配，獲取穩(wěn)定傳代的BMP4CRNAi小鼠,；穩(wěn)定傳代的BMP4CRNAi小鼠與Col2a1-cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配,，獲取BMP4 Col2a1-CRNAi小鼠，分離BMP4 Col2a1-CRNAi小鼠原代軟骨細胞,，提取總RNA,，利用半定量RT-PCR檢測干擾效率。
通過PCR篩選和測序驗證結(jié)果表明：成功構(gòu)建BMP4條件性敲低載體,；PCR和RT－PCR結(jié)果表明：成功獲得條件性RNAi轉(zhuǎn)基因小鼠以及在軟骨細胞中敲低BMP4的小鼠,，敲低效率為81％。這些結(jié)果表明,，他們成功制備出了BMP4CRNAi小鼠和BMP4 Col2a1-CRNAi小鼠,。這種小鼠模型的建立，為研究BMP4在不同組織細胞的功能奠定了基礎(chǔ),，并且也為研究BMP4在軟骨發(fā)育中的作用提供了合適的動物模型,。
 
    另外，陳林教授率領(lǐng)的研究組還建立成功了條件性缺氧誘導因子－1α RNAi轉(zhuǎn)基因小鼠模型,。
 
    缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor-1α,，HIF-1α）是細胞在缺氧等條件下穩(wěn)定表達的具有轉(zhuǎn)錄活性的蛋白，通過與多種靶基因調(diào)控區(qū)的缺氧反應(yīng)元件（hypoxia response element,，HRE）結(jié)合,調(diào)控靶基因表達,使機體對缺氧,、缺血等病理生理過程產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)。
 
    研究人員指出,，為了從整體動物水平研究HIF-1α的作用,，就需要建立HIF-1α相關(guān)遺傳修飾小鼠,。
 
    因此，他們分別針對HIF-1α mRNA序列的兩個靶位點合成兩對互補的寡核苷酸鏈,，構(gòu)建可誘導的RNA干擾真核表達載體HIF-AB和HIF-CD,。分別將CRE重組酶真核表達載體CRE-ERT2與HIF-AB或HIF-CD轉(zhuǎn)染入RAW264.7細胞，篩選得到穩(wěn)定表達CRE-ERT2與HIF-AB,，或CRE-ERT2與HIF-CD的穩(wěn)定細胞系,。
 
    在用4-HT誘導去除上述細胞系中HIF-AB或HIF-CD所含的Neo基因后，用CoCl2誘導HIF-1α表達,，采用半定量RT-PCR檢測HIF-AB或HIF-CD對HIF-1α 基因表達的影響。
 
    結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾載體（HIF-AB和HIF-CD）對HIF-1α mRNA序列的沉默效果分別為85%和72%,。選擇干擾效率較高的表達載體HIF-AB經(jīng)顯微注射獲得HIF-1α基因敲低小鼠模型,，經(jīng)PCR以及測序驗證已獲得2個轉(zhuǎn)基因陽性小鼠（Founders，G0代）,。G0代雄鼠與FVB/N雌鼠交配后獲得2只F1代（first filial generation）轉(zhuǎn)基因陽性小鼠,，經(jīng)與EIIA-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配，得到EIIA-Cre;HIFRNAiflox/+小鼠,，RT-PCR結(jié)果顯示,，EIIA-Cre;HIFRNAiflox/+小鼠肝、肺,、腎等組織的HIF-1α mRNA水平明顯降低,，分別約為正常對照的44%、38.2%和23.5%,。
 
    研究人員表示,，該小鼠模型的建立為進一步研究HIF-1α的功能及作用機制提供了新的手段。
 
    陳林,，男,，第三軍醫(yī)大學教授，受聘為國家教育部第五批“長江學者獎勵計劃特聘教授”,，聘任崗位：外科學野戰(zhàn)外科,。