采用生物路線來合成化學(xué)物質(zhì)承擔(dān)著未來化學(xué)物質(zhì)生產(chǎn)的重任，對于一些利用不可再生能源生產(chǎn)的或難以采用傳統(tǒng)合成方法生產(chǎn)的化學(xué)物質(zhì)而言尤其如此,。合成化學(xué)物質(zhì)比較普遍的策略是利用一種基于活細胞合成潛力的代謝工程途徑,，但是這種方法常常會遇到瓶頸，其中包括有用的代謝產(chǎn)物流失,，以及有毒中間產(chǎn)物的堆積,。在這個問題上，加州大學(xué)伯克利分校Dueber等人在2009年第8期Nature biotechnology上發(fā)表的研究表明,，利用人工合成的支架蛋白能夠募集代謝酶類,，可以極大地提高甲羥戊酸（類異戊二烯前體如抗瘧疾藥物青蒿素）的產(chǎn)量，同時降低整體細胞的代謝負荷,。這項研究首次在微生物體內(nèi)利用定向的組裝酶復(fù)合物,，從而對化學(xué)物質(zhì)的合成進行了優(yōu)化，并為現(xiàn)有的代謝工程技術(shù)提供了補充,。
自然界為共位酶的催化反應(yīng)及相應(yīng)底物反應(yīng)途徑設(shè)計了完美的策略,。這些策略包括促進酶活性位點實現(xiàn)物理結(jié)合（色氨酸合成酶和氨基甲酰磷酸合成酶的結(jié)合）的共位酶生成保護渠道以及使底物實現(xiàn)與復(fù)合酶模塊（通過蛋白質(zhì)的相互作用聚合起來）共價連接，并沿模塊依次移動的底物組裝線（聚酮合成酶）,。然而到目前為止,，很少在微生物工程中利用這種酶的組裝來提高多步的代謝反應(yīng)。這種設(shè)想僅僅局限于融合蛋白,，其結(jié)果也有好有壞,。一個成功的案例是，實驗室在改進生產(chǎn)甘油的高產(chǎn)大腸桿菌菌株（Escherichia coli）時,，意外發(fā)現(xiàn)編碼甘油三磷脫氫酶1 （GPD1）和甘油三磷酶2（GPP2）的基因之間發(fā)生了重組,，結(jié)果產(chǎn)生了兼具甘油三磷脫氫酶1和甘油三磷酶2活性的融合蛋白。然而,，研究人員顯然需要探討簡單的融合蛋白以外的其他辦法,，并制定計劃以更好的模仿那些在自然界中發(fā)現(xiàn)的順序酶反應(yīng)的空間組織設(shè)計。
Dueber等人通過建立穩(wěn)固的細胞內(nèi)支架，從而使進行連續(xù)酶促反應(yīng)的酶能夠通過小肽配體能夠成功對接,。這些細胞內(nèi)支架包含一系列由多細胞動物的基因組編碼的高度特異性的模塊化對接區(qū)域：GTP酶結(jié)合域（GBD）來自控制肌動蛋白聚合的NWASP,，SH3結(jié)合域來自CRK蛋白，PDZ的結(jié)合域則來自互生蛋白,。甲羥戊酸生產(chǎn)過程中的三種酶——大腸桿菌AtoB,、釀酒酵母HMGS和HMGR，通過配體與對接區(qū)域的特異性的結(jié)合,，從而實現(xiàn)在細胞內(nèi)骨架上的定位,。
這項酶組裝策略的優(yōu)點是，它僅需要對靶向酶稍做修改,，而不需要酶的結(jié)構(gòu)信息,，類似于親和純化額外的融合標(biāo)記。Dueber等研究表明,，由非共價方式將酶與合成的細胞內(nèi)支架結(jié)合,，與不使用支架途徑相比甲羥戊酸的產(chǎn)量可能增加了近77倍，這些依賴于相互作用結(jié)構(gòu)域的重復(fù)數(shù)和結(jié)構(gòu)域在支架上的位置,。這種支架的設(shè)計意味著技術(shù)發(fā)展水平相當(dāng)大的進步,，因為它能夠使兩個或兩個以上酶系統(tǒng)中實現(xiàn)多種酶的組合和酶的位置。該策略能夠同時從空間和化學(xué)計量上配置多個酶的能力非常重要,，因為它能平衡整個反應(yīng)通路的反應(yīng)速率,。
令人興奮的是，這種支架還能夠促進結(jié)構(gòu)上無關(guān)化合物——葡萄糖的生產(chǎn),，研究表明,，這種做法還能夠延伸到用于其他代謝途徑。但是,，在制定其他合成支架系統(tǒng)中仍有幾個重要問題需要考慮,。首先，許多代謝酶實際上都是多聚體,，如果酶的亞基被支架結(jié)構(gòu)整個或部分覆蓋,，可能會造成多種后果。同樣,，能否成功的用配體來標(biāo)記酶主要取決于蛋白結(jié)構(gòu),，所以更徹底的尋找肽插入位點可能有必要。還需要進一步完善支架配體相互作用,，從而能夠確保支架組裝更“干凈”,，并防止大量的無酶的支架或無支架的酶的積累。
應(yīng)當(dāng)指出的是,，新陳代謝途徑的概念并非沒有爭議，因為對其影響的直接測量還被實驗證據(jù)所困擾。Dueber等人推測,，酶是通過提高中介代謝物的有效濃度來提高酶促反應(yīng)的效率,。然而，也有其他可能的機制有助于增加甲羥戊酸產(chǎn)物的產(chǎn)量,，包括改善酶的折疊,，減少酶的聚集或退化，或這些措施的結(jié)合,。最后,，即使這種途徑的效應(yīng)是真實的，也僅可能在對酶通量經(jīng)過仔細平衡的高度工程化的系統(tǒng)中有效,，對酶通量的平衡時是基于這種酶在生產(chǎn)葡萄糖酸沒有生產(chǎn)甲醛戊酸有效的發(fā)現(xiàn)進行的,。不管怎樣，使用合成酶支架明顯提高了代謝性能,，并提供了一個能夠與傳統(tǒng)方法,，比如通過調(diào)節(jié)基因間隔區(qū)域或調(diào)節(jié)限速酶從而調(diào)節(jié)酶的表達水平，同時使用的強大的新方法,。在長遠來看,，同時整合的這幾種策略來平衡酶促反應(yīng)，消除代謝障礙,，減少細胞斜坡,，防止非必要的中間產(chǎn)物或副產(chǎn)品的積累是很有可能的，這勢必會為各種代謝產(chǎn)物,，如生物燃料,、特種化學(xué)品和新的疾病治療方法，在各個水平上進行的商業(yè)化生產(chǎn)掃清障礙,。（生物谷Bioon.com）
生物谷推薦原始出處：
Nature Biotechnology 27, 728 - 729 (2009) doi:10.1038/nbt0809-728
Synthetic metabolic pipelines
1 Matthew P DeLisa1 & Robert J Conrado1
2 Matthew P. DeLisa and Robert J. Conrado are at the School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University, Ithaca, New York, USA.
Controlling the spatial organization of sequential metabolic enzymes may provide a general strategy for increasing the production of valuable compounds.
