美國Dana-Farber癌癥研究所癌癥系統(tǒng)生物學(xué)中心（CCSB）的研究人員將PCR拼接與新一代測序結(jié)合起來，用于蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析,。該研究成果近日發(fā)表在《自然—方法學(xué)》（Nature Methods）在線版上,。
細(xì)胞中存在著成百上千個大分子的相互作用,，它們介導(dǎo)的功能維持了正常的細(xì)胞活性。為了大規(guī)模確定多種生物中的相互作用,，人們已經(jīng)開發(fā)出多種高通量的方法,，如酵母雙雜交系統(tǒng)。然而,，目前的高通量蛋白相互作用組（interactome）的數(shù)據(jù)集質(zhì)量雖高,，但覆蓋度很低。對于人類而言,，95%以上的相互作用組還有待定位,。
酵母雙雜交系統(tǒng)等高通量定位方法的瓶頸在于確定相互作用的蛋白、DNA或RNA分子的身份,。新一代測序技術(shù)的補充有望提高通量,，同時降低成本。近幾年來,，新一代測序廣泛應(yīng)用在生物學(xué)的多個方面,，但尚未應(yīng)用在蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)定位，因為通過集體測序無法了解每個相互作用對的成員之間的關(guān)聯(lián),。
盡管“鳥槍法”測序能夠高效測定基因組和轉(zhuǎn)錄組,，但新一代測序技術(shù)無法直接鑒定相互作用對。于是,，Dana-Farber癌癥研究所Marc Vidal領(lǐng)導(dǎo)的研究小組將PCR拼接（PCR stitching）與新一代測序結(jié)合起來,，開發(fā)出一種大規(guī)模并行定位相互作用組的策略（Stitch-seq），并在高通量酵母雙雜交系統(tǒng)中檢驗了這種策略,。
他們通過PCR將編碼相互作用對雜交蛋白的開放閱讀框（ORF）或cDNA擴增出來,，并通過Sanger或新一代測序來鑒定。X與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合（DB-X）,，Y與激活結(jié)構(gòu)域融合（AD-Y）,。當(dāng)X和Y來源于配對PCR平板的記錄位置，它們可通過計算機重組,，形成相互作用序列標(biāo)簽（ISTs）,。
作者提到，他們的策略使整體費用降低了近40%,，并允許通量增加,。隨著新一代測序技術(shù)的不斷改善，測序費用應(yīng)當(dāng)持續(xù)下降,。作者在研究中選擇了454 GS FLX測序平臺,。之所以選擇這個平臺,，是因為454技術(shù)是新一代測序中讀長最長的，而82 bp的接頭長度要求平均讀長要超過100 bp,，才能可靠鑒定相互作用序列標(biāo)簽,。
作者認(rèn)為，Stitch-seq不僅適用于酵母雙雜交系統(tǒng),，還可擴展到其他類型的相互作用分析,，改善相互作用組網(wǎng)絡(luò)定位的能力和范圍。（生物谷Bioon.com）
生物谷推薦原文出處：
Nature Methods DOI:10.1038/nmeth.1597
Next-generation sequencing to generate interactome datase
Haiyuan Yu; Leah Tardivo; Stanley Tam; Evan Weiner; Fana Gebreab; Changyu Fan; Nenad Svrzikapa; Tomoko Hirozane-Kishikawa; Edward Rietman; Xinping Yang; Julie Sahalie; Kourosh Salehi-Ashtiani; Tong Hao; Michael E Cusick; David E Hill; Frederick P Roth; Pascal Braun; Marc Vidal
Next-generation sequencing has not been applied to protein-protein interactome network mapping so far because the association between the members of each interacting pair would not be maintained in en masse sequencing. We describe a massively parallel interactome-mapping pipeline, Stitch-seq, that combines PCR stitching with next-generation sequencing and used it to generate a new human interactome dataset. Stitch-seq is applicable to various interaction assays and should help expand interactome network mapping.
