由于DNA長(zhǎng)鏈常常出現(xiàn)單個(gè)堿基的缺失或是損傷,，因此DNA損傷相當(dāng)常見，每天每個(gè)細(xì)胞大約有100萬個(gè)分子損害,。這些損傷可以造成DNA復(fù)制過程停滯,，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡,。為了避免它，細(xì)胞利用幾個(gè)信號(hào)通路來繞過損傷繼續(xù)DNA復(fù)制過程,。近日來自西班牙巴塞羅那大學(xué)的研究人員利用一些單分子操縱技術(shù)在體外重現(xiàn)了其中的一個(gè)過程,。相關(guān)研究發(fā)表在11月30日的《科學(xué)》（Science）雜志上。
“早在上世紀(jì)70年代人們就提出了這一信號(hào)通路,，現(xiàn)在通過操縱單分子我們?cè)谑删w上證實(shí)了它,。相比于傳統(tǒng)的生化技術(shù)研究大量的分子，我們的單分子操縱技術(shù)能夠在單分子水平上實(shí)時(shí)研究單個(gè)蛋白的作用機(jī)制,，”巴塞羅那大學(xué)基礎(chǔ)物理學(xué)系教授Maria Manosas說,。
為了研究單個(gè)分子，研究人員采用了磁性鑷子,。這一技術(shù)是將一段DNA發(fā)夾連接在玻璃表面與一個(gè)磁珠之間,。當(dāng)磁體系統(tǒng)產(chǎn)生磁場(chǎng)時(shí)，可操縱磁珠產(chǎn)生磁場(chǎng)力,。這一系統(tǒng)是通過檢測(cè)磁珠來衡量DNA鏈延伸改變,。Manosas說：“通過分子的延伸變化可以推斷出DNA上的蛋白質(zhì)活動(dòng)。因?yàn)榘l(fā)生這些改變是蛋白質(zhì)在起作用,。”
在DNA復(fù)制過程中,，兩條DNA模板鏈分開合成互補(bǔ)鏈。新的互補(bǔ)鏈再分別與一條初始鏈聯(lián)結(jié),，從而獲得兩個(gè)與初始DNA分子相同的拷貝。在這一過程中,，一個(gè)稱為聚合酶的酶家族參與完成所有形式的DNA復(fù)制,。當(dāng)新生DNA鏈中的任何一條，尤其是前導(dǎo)鏈（leading strand）存在損傷時(shí),，聚合酶會(huì)停止合成堿基,，由此導(dǎo)致復(fù)制過程停滯。Manosas說：“這一過程停滯可引起細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)某些問題,。當(dāng)這一復(fù)制機(jī)制（復(fù)制體）遭受解離時(shí),，本研究中分析的旁路過程就會(huì)啟動(dòng)。”
研究初始研究人員將焦點(diǎn)放在一種解鏈酶蛋白(UvsW)上,。UvsW能夠促進(jìn)DNA鏈結(jié)合（這一現(xiàn)象就稱之為DNA雜交）,，還能夠以未受損的復(fù)制鏈作為模板構(gòu)建一種稱為“霍利迪連結(jié)體”（Holliday junction）的中間結(jié)構(gòu)，與聚合酶一起作用,，推動(dòng)系統(tǒng)回到出發(fā)點(diǎn),，一旦“跳過”損傷，隨后就可以重啟DNA重復(fù)制過程,。因此當(dāng)一條鏈?zhǔn)軗p時(shí),，可利用另一條完整鏈作為備份恢復(fù)丟失的信息,；這一過程就稱之為“模板轉(zhuǎn)換策略”。“在本研究中,，我們觀測(cè)了這一信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制,，以及解鏈酶UvsW的退火速度，最快為每秒1500個(gè)堿基,，” Manosas說,。
DNA修復(fù)對(duì)大量疾病至關(guān)重要。深入了解這些現(xiàn)象將使我們能夠著手研究某些在人類中具有相似功能的蛋白,。Manosas正在這一方向上展開研究,，著重解析一種稱作HARP的人類蛋白以了解其作用機(jī)制,。眾所周知,，HARP在基因組保守性中起非常重要的作用，它的功能障礙與某些類型的癌癥相關(guān),。(生物谷Bioon.com)
DOI: 10.1126/science.1225437
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Direct Observation of Stalled Fork Restart via Fork Regression in the T4 Replication System
Maria Manosas1,2,5,*, Senthil K. Perumal4,*, Vincent Croquette2,3,†, Stephen J. Benkovic4,†
The restart of a stalled replication fork is a major challenge for DNA replication. Depending on the nature of the damage, different repair processes might be triggered; one is template switching, which is a bypass of a leading-strand lesion via fork regression. Using magnetic tweezers to study the T4 bacteriophage enzymes, we have reproduced in vitro the complete process of template switching. We show that the UvsW DNA helicase in cooperation with the T4 holoenzyme can overcome leading-strand lesion damage by a pseudostochastic process, periodically forming and migrating a four-way Holliday junction. The initiation of the repair process requires partial replisome disassembly via the departure of the replicative helicase. The results support the role of fork regression pathways in DNA repair.
