摘要 為了探討銀杏葉提取物對中樞神經系統(tǒng)高級機能活動的作用, 為臨床應用銀杏葉提取物治療認知功能障礙提供實驗依據, 采用東莨菪堿所致老齡大鼠學習記憶障礙的擬老年性癡呆動物模型, 以水迷宮和避暗實驗等學習記憶行為訓練及生化檢測方法, 觀察用藥前后動物學習記憶行為和海馬乙酰膽堿及蛋白質含量的變化。
實驗結果顯示: 銀杏葉提取物呈劑量依賴性顯著改善實驗動物的學習記憶能力 (P < 0105 或P < 0101) , 并顯著增加海馬腦區(qū)乙酰膽堿含量(P < 0105 或P < 0101),。結果表明: 銀杏葉提取物可改善癡呆鼠學習記憶功能障礙,。
關鍵詞 銀杏葉提取物，乙酰膽堿,，學習記憶障礙
銀杏是一種具有多種藥理作用的中藥, 從銀杏葉中提取的主要藥用成分為總黃酮類及銀杏內酯等, 簡稱為銀杏葉提取物(ex t ract s of ginkgo b iloba leaves,EGB),。近年研究顯示, EGB 是一種天然的自由基清除劑, 可保護機體免受自由基引起的損害, 改善腦循環(huán)障礙和神經元的功能, 目前國內外已將EGB 廣泛應用于治療冠心病和腦缺血, 而關于EGB 對認知功能等高級神經功能活動影響的實驗或臨床研究少見報道。本研究旨在探討EGB 對擬老年性癡呆大鼠學習記憶能力的影響, 并初步研究其可能機制, 為臨床合理應用EGB 提供一定的實驗依據,。
1 材料和方法
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗動物: 老年雄性W istar 大鼠, 月齡約20～24月, 體重650～820 g (幼齡鼠喂養(yǎng)至老齡) , 老年性癡呆動物模型參考 [ 1 ]的方法建立,。
1.1.2 藥物: 銀杏葉提取物EGB (含總黃酮甙24% ,總內酯60% ); 東莨菪堿,。
1.2 實驗方法
1.2.1 實驗分組: 將大鼠隨機分為5 組: 正常老齡對照組、模型組,、EGB 小劑量組 (75m gö kg),、EGB中劑量組 (150 m gö kg) , EGB 大劑量組 (500 m gökg) , 每組8 只, 采用灌胃給藥, 其中正常老齡對照組和模型組以相同體積的生理鹽水灌胃, 單次連續(xù)給藥5 d, 于第6 d 測試水迷宮及避暗試驗, 測試期間停止灌藥。實驗動物飼養(yǎng)于 (22±3) ℃環(huán)境中, 自由飲水, 自然光照,。
1.2.2 學習記憶行為訓練與學習記憶能力評定: ①分辨學習記憶訓練與評估: 采用水迷宮法測試藥物對擬癡呆大鼠學習記憶能力的影響,。以癡呆大鼠自水迷宮起點游至終點安全臺所需時間和途中進入盲端的錯誤次數, 作為衡量學習獲得與記憶鞏固能力的指標。②回避反應: 采用避暗試驗測試藥物對擬癡呆大鼠學習,、記憶能力的影響,。以大鼠到達暗環(huán)境被動回避試驗所需時間和電擊次數, 作為大鼠學習獲得和記憶鞏固能力的觀察指標。
1.2.3 海馬乙酰膽堿,、蛋白質含量測定
改進的方法, 通過堿羥胺比色法測定海馬的乙酰膽堿含量,。海馬蛋白含量測定方法如下: 在完成各實驗步驟后, 將各組大鼠快速斷頭處死, 取海馬部位分別稱重, 加入T r is2 HCl緩沖液 (pH712) 研磨勻漿,離心、過濾,。Low ry 法測定海馬腦區(qū)的蛋白質含量,。
1.3 統(tǒng)計學處理
所有實驗數據均用 x q±s 表示, 數據處理采用 t檢驗及方差分析, 顯著性水平為 P < 0105 或 P <0101。
2 結果
2.1 EGB對東莨菪堿 (Scop) 所致學習記憶障礙老齡鼠學習記憶能力的影響
連續(xù)7 d 的水迷宮試驗發(fā)現: EGB 各劑量組造模大鼠游迷宮所需時間和途中錯誤次數均明顯少于模型組 (P < 0105 或P < 0101) , EGB 大,、中,、小劑量組相互比較, 差異均具有顯著性意義 (P < 0105 或P< 0101),。模型組與正常老齡對照組比較, 前者大鼠游迷宮所需時間和途中錯誤次數明顯高于后者 (P <0101) ,。
EGB 大、中,、小劑量組造模大鼠為達到暗環(huán)境被動回避試驗內容, 學習過程明顯短于模型組 (P <0105或P < 0101),。EGB 大、中,、小劑量組學會所需時間相互比較均有明顯差別 (P<0101) , 模型組學習時間較正常老年對照組顯著延長(P < 0101) ; EGB各劑量組發(fā)生電擊的錯誤次數也明顯少于模型組 (P<0101) , EGB 大劑量組電擊次數顯著少于中劑量組(P < 0101) 中劑量組明顯少于小劑量組 (P < 0105) ,。
2.2 EGB 對Scop 所致學習記憶障礙老齡鼠海馬腦區(qū)乙酰膽堿 (Ach) 及蛋白質含量的影響
EGB 大、中,、小劑量組造模大鼠海馬A ch 含量明顯高于模型組 (P < 0105 或P < 0101) , 而EGB 大劑量組的海馬A ch 含量顯著高于EGB 中,、小劑量組(P < 0101)。另外, 與正常老齡對照組比較, 東莨菪堿致學習記憶障礙模型組大鼠海馬腦區(qū)的蛋白質含量顯著降低 (P < 0101) , 在給予EGB 后, 造模后的實驗大鼠海馬腦區(qū)蛋白質含量雖有所增加, 但無統(tǒng)計學意義 (P > 0105) ,
3 討論
銀杏是地球上存活最久的植物之一, 銀杏葉始載于《本草品匯精要》 , 作為祖國的傳統(tǒng)中藥已沿用數千年,。由于銀杏葉的有效成分已基本確認, 近年來出現了一些關于銀杏葉的臨床藥理學及應用研究,。有跡象表明[4], 銀杏葉提取物EGB 可能有提高學習記憶功能的作用, 但其具體機制有待深入探討, 尤其EGB對老年性癡呆型學習記憶功能障礙的防治機理少見報導。
制作接近人類老年性癡呆的理想動物模型直接關系到實驗的可靠性和實用價值, 近年來雖已建立多種擬老年性癡呆動物模型, 但多數僅能模擬老年性癡呆的生化,、病理等某一方面改變, 因而對老年性癡呆發(fā)病機制及防治措施的深入研究有待開發(fā)更理想的動物模型,。據報道[ 5 ], 通過抗膽堿能藥物東莨菪堿建立的大鼠學習記憶障礙模型可作為研究老年性癡呆智能障礙的有效動物模型之一。本實驗采用老齡大鼠造模, 更符合擬老年性癡呆動物的老齡特點, 也更接近人類老年性癡呆患者的機能狀態(tài),。我們的實驗結果發(fā)現: 模型組大鼠學習記憶能力顯著低于正常老齡對照組, 提示本造模法穩(wěn)定可靠, 適用于學習記憶等高級神經功能活動的研究,。本研究通過水迷宮及避暗試驗發(fā)現: EGB 能有效改善癡呆大鼠學習記憶能力, 提示EGB 在一定程度上可緩解癡呆老齡大鼠的智能障礙, 在 75～ 500m gö kg 范圍內, EGB 的這種藥理作用呈劑量依賴性增強,。Chop in 等[ 6 ]對A lzheim er 病引起的記憶功能失調的小鼠模型, 給予EGB 150～ 500 m gö kg, 能明顯減弱遺忘作用。另有類似研究指出EGB 呈劑量依賴性提高正常大鼠的學習記憶能力[ 7 ],。近年來有關EGB 的臨床療效觀察也發(fā)現 EGB 可明顯改善血管性癡呆患者的智能障礙, 這種作用可能與EGB 加速神經沖動的傳導, 易化突觸傳遞, 從而有利于信息獲得,、記憶鞏固和再現有關[4,8]。由此可見, EGB 是一類作用廣泛,、療效肯定的益智藥, 具備較好的臨床應用前景,。
研究顯示, 海馬區(qū)蛋白質合成率的高低與學習記憶有密切關系[9], 另有研究發(fā)現東莨菪堿所致學習記憶障礙的機制可能是由于東莨菪堿抑制了腦內尤其海馬區(qū)突觸體蛋白質的合成, 影響神經信息的突觸傳遞, 導致大鼠的學習記憶能力受到影響[1]。本實驗模型組大鼠海馬區(qū)蛋白質較正常老齡對照組顯著降低,與上述結論相符, 也進一步說明本造模法經改進后仍穩(wěn)定可靠,。本實驗還表明, EGB與其它益智藥不同,它并未明顯增加癡呆大鼠海馬區(qū)業(yè)已降低的蛋白質含量, 故對蛋白質合成的促進作用可能不是EGB的益智作用機制,。
中樞膽堿能系統(tǒng)的海馬膽堿能投射纖維及基底前腦膽堿能細胞的功能障礙是導致各種類型癡呆動物學習記憶能力下降的重要原因, 這一研究成果為探討動物學習記憶病理生理機制建立了一定的形態(tài)學和物質基礎。我們的實驗發(fā)現EGB 能明顯提高老齡癡呆鼠海馬腦區(qū)的A ch 含量, 且這種促進作用也呈劑量依賴性關系, 據此推測, EGB 可能通過增加學習記憶功能腦區(qū)的A ch 含量而改善癡呆動物的智能障礙,。為了更深入全面地認識EGB 對老年性癡呆的益智機理, 尚待開展多模型,、多劑型、多時程,、多指標的系統(tǒng)研究,。
實驗結果顯示: 銀杏葉提取物呈劑量依賴性顯著改善實驗動物的學習記憶能力 (P < 0105 或P < 0101) , 并顯著增加海馬腦區(qū)乙酰膽堿含量(P < 0105 或P < 0101),。結果表明: 銀杏葉提取物可改善癡呆鼠學習記憶功能障礙,。
關鍵詞 銀杏葉提取物，乙酰膽堿,，學習記憶障礙
銀杏是一種具有多種藥理作用的中藥, 從銀杏葉中提取的主要藥用成分為總黃酮類及銀杏內酯等, 簡稱為銀杏葉提取物(ex t ract s of ginkgo b iloba leaves,EGB),。近年研究顯示, EGB 是一種天然的自由基清除劑, 可保護機體免受自由基引起的損害, 改善腦循環(huán)障礙和神經元的功能, 目前國內外已將EGB 廣泛應用于治療冠心病和腦缺血, 而關于EGB 對認知功能等高級神經功能活動影響的實驗或臨床研究少見報道。本研究旨在探討EGB 對擬老年性癡呆大鼠學習記憶能力的影響, 并初步研究其可能機制, 為臨床合理應用EGB 提供一定的實驗依據,。
1 材料和方法
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗動物: 老年雄性W istar 大鼠, 月齡約20～24月, 體重650～820 g (幼齡鼠喂養(yǎng)至老齡) , 老年性癡呆動物模型參考 [ 1 ]的方法建立,。
1.1.2 藥物: 銀杏葉提取物EGB (含總黃酮甙24% ,總內酯60% ); 東莨菪堿,。
1.2 實驗方法
1.2.1 實驗分組: 將大鼠隨機分為5 組: 正常老齡對照組、模型組,、EGB 小劑量組 (75m gö kg),、EGB中劑量組 (150 m gö kg) , EGB 大劑量組 (500 m gökg) , 每組8 只, 采用灌胃給藥, 其中正常老齡對照組和模型組以相同體積的生理鹽水灌胃, 單次連續(xù)給藥5 d, 于第6 d 測試水迷宮及避暗試驗, 測試期間停止灌藥。實驗動物飼養(yǎng)于 (22±3) ℃環(huán)境中, 自由飲水, 自然光照,。
1.2.2 學習記憶行為訓練與學習記憶能力評定: ①分辨學習記憶訓練與評估: 采用水迷宮法測試藥物對擬癡呆大鼠學習記憶能力的影響,。以癡呆大鼠自水迷宮起點游至終點安全臺所需時間和途中進入盲端的錯誤次數, 作為衡量學習獲得與記憶鞏固能力的指標。②回避反應: 采用避暗試驗測試藥物對擬癡呆大鼠學習,、記憶能力的影響,。以大鼠到達暗環(huán)境被動回避試驗所需時間和電擊次數, 作為大鼠學習獲得和記憶鞏固能力的觀察指標。
1.2.3 海馬乙酰膽堿,、蛋白質含量測定
改進的方法, 通過堿羥胺比色法測定海馬的乙酰膽堿含量,。海馬蛋白含量測定方法如下: 在完成各實驗步驟后, 將各組大鼠快速斷頭處死, 取海馬部位分別稱重, 加入T r is2 HCl緩沖液 (pH712) 研磨勻漿,離心、過濾,。Low ry 法測定海馬腦區(qū)的蛋白質含量,。
1.3 統(tǒng)計學處理
所有實驗數據均用 x q±s 表示, 數據處理采用 t檢驗及方差分析, 顯著性水平為 P < 0105 或 P <0101。
2 結果
2.1 EGB對東莨菪堿 (Scop) 所致學習記憶障礙老齡鼠學習記憶能力的影響
連續(xù)7 d 的水迷宮試驗發(fā)現: EGB 各劑量組造模大鼠游迷宮所需時間和途中錯誤次數均明顯少于模型組 (P < 0105 或P < 0101) , EGB 大,、中,、小劑量組相互比較, 差異均具有顯著性意義 (P < 0105 或P< 0101),。模型組與正常老齡對照組比較, 前者大鼠游迷宮所需時間和途中錯誤次數明顯高于后者 (P <0101) ,。
EGB 大、中,、小劑量組造模大鼠為達到暗環(huán)境被動回避試驗內容, 學習過程明顯短于模型組 (P <0105或P < 0101),。EGB 大、中,、小劑量組學會所需時間相互比較均有明顯差別 (P<0101) , 模型組學習時間較正常老年對照組顯著延長(P < 0101) ; EGB各劑量組發(fā)生電擊的錯誤次數也明顯少于模型組 (P<0101) , EGB 大劑量組電擊次數顯著少于中劑量組(P < 0101) 中劑量組明顯少于小劑量組 (P < 0105) ,。
2.2 EGB 對Scop 所致學習記憶障礙老齡鼠海馬腦區(qū)乙酰膽堿 (Ach) 及蛋白質含量的影響
EGB 大、中,、小劑量組造模大鼠海馬A ch 含量明顯高于模型組 (P < 0105 或P < 0101) , 而EGB 大劑量組的海馬A ch 含量顯著高于EGB 中,、小劑量組(P < 0101)。另外, 與正常老齡對照組比較, 東莨菪堿致學習記憶障礙模型組大鼠海馬腦區(qū)的蛋白質含量顯著降低 (P < 0101) , 在給予EGB 后, 造模后的實驗大鼠海馬腦區(qū)蛋白質含量雖有所增加, 但無統(tǒng)計學意義 (P > 0105) ,
3 討論
銀杏是地球上存活最久的植物之一, 銀杏葉始載于《本草品匯精要》 , 作為祖國的傳統(tǒng)中藥已沿用數千年,。由于銀杏葉的有效成分已基本確認, 近年來出現了一些關于銀杏葉的臨床藥理學及應用研究,。有跡象表明[4], 銀杏葉提取物EGB 可能有提高學習記憶功能的作用, 但其具體機制有待深入探討, 尤其EGB對老年性癡呆型學習記憶功能障礙的防治機理少見報導。
制作接近人類老年性癡呆的理想動物模型直接關系到實驗的可靠性和實用價值, 近年來雖已建立多種擬老年性癡呆動物模型, 但多數僅能模擬老年性癡呆的生化,、病理等某一方面改變, 因而對老年性癡呆發(fā)病機制及防治措施的深入研究有待開發(fā)更理想的動物模型,。據報道[ 5 ], 通過抗膽堿能藥物東莨菪堿建立的大鼠學習記憶障礙模型可作為研究老年性癡呆智能障礙的有效動物模型之一。本實驗采用老齡大鼠造模, 更符合擬老年性癡呆動物的老齡特點, 也更接近人類老年性癡呆患者的機能狀態(tài),。我們的實驗結果發(fā)現: 模型組大鼠學習記憶能力顯著低于正常老齡對照組, 提示本造模法穩(wěn)定可靠, 適用于學習記憶等高級神經功能活動的研究,。本研究通過水迷宮及避暗試驗發(fā)現: EGB 能有效改善癡呆大鼠學習記憶能力, 提示EGB 在一定程度上可緩解癡呆老齡大鼠的智能障礙, 在 75～ 500m gö kg 范圍內, EGB 的這種藥理作用呈劑量依賴性增強,。Chop in 等[ 6 ]對A lzheim er 病引起的記憶功能失調的小鼠模型, 給予EGB 150～ 500 m gö kg, 能明顯減弱遺忘作用。另有類似研究指出EGB 呈劑量依賴性提高正常大鼠的學習記憶能力[ 7 ],。近年來有關EGB 的臨床療效觀察也發(fā)現 EGB 可明顯改善血管性癡呆患者的智能障礙, 這種作用可能與EGB 加速神經沖動的傳導, 易化突觸傳遞, 從而有利于信息獲得,、記憶鞏固和再現有關[4,8]。由此可見, EGB 是一類作用廣泛,、療效肯定的益智藥, 具備較好的臨床應用前景,。
研究顯示, 海馬區(qū)蛋白質合成率的高低與學習記憶有密切關系[9], 另有研究發(fā)現東莨菪堿所致學習記憶障礙的機制可能是由于東莨菪堿抑制了腦內尤其海馬區(qū)突觸體蛋白質的合成, 影響神經信息的突觸傳遞, 導致大鼠的學習記憶能力受到影響[1]。本實驗模型組大鼠海馬區(qū)蛋白質較正常老齡對照組顯著降低,與上述結論相符, 也進一步說明本造模法經改進后仍穩(wěn)定可靠,。本實驗還表明, EGB與其它益智藥不同,它并未明顯增加癡呆大鼠海馬區(qū)業(yè)已降低的蛋白質含量, 故對蛋白質合成的促進作用可能不是EGB的益智作用機制,。
中樞膽堿能系統(tǒng)的海馬膽堿能投射纖維及基底前腦膽堿能細胞的功能障礙是導致各種類型癡呆動物學習記憶能力下降的重要原因, 這一研究成果為探討動物學習記憶病理生理機制建立了一定的形態(tài)學和物質基礎。我們的實驗發(fā)現EGB 能明顯提高老齡癡呆鼠海馬腦區(qū)的A ch 含量, 且這種促進作用也呈劑量依賴性關系, 據此推測, EGB 可能通過增加學習記憶功能腦區(qū)的A ch 含量而改善癡呆動物的智能障礙,。為了更深入全面地認識EGB 對老年性癡呆的益智機理, 尚待開展多模型,、多劑型、多時程,、多指標的系統(tǒng)研究,。
