據(jù)說(shuō)人體內(nèi)的血管首尾相接長(zhǎng)度可達(dá)10多萬(wàn)公里,，血液每天在其間奔跑,，有的是“高速路”，有的是“國(guó)道”,，有的又是“鄉(xiāng)間小路”,。“新路”往往平滑順暢,、暢通無(wú)阻,，“老路”往往會(huì)坑坑洼洼、磕磕絆絆,，有沒(méi)有可能通過(guò)生物技術(shù)的手段對(duì)“老路”進(jìn)行修補(bǔ)呢,？
日前，《細(xì)胞干細(xì)胞》雜志在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所劉光慧研究組,、北京大學(xué)湯富酬研究組和中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所曲靜研究組的聯(lián)合研究成果——通過(guò)靶向編輯單個(gè)長(zhǎng)壽基因獲得首例遺傳增強(qiáng)的人類血管細(xì)胞,。
“我們?cè)谌伺咛ジ杉?xì)胞中進(jìn)行基因編輯操作，對(duì)編輯后的干細(xì)胞進(jìn)行定向分化,，可在實(shí)驗(yàn)室中獲得人類血管內(nèi)皮細(xì)胞（血管內(nèi)膜）,、血管平滑肌細(xì)胞（血管中膜）及間質(zhì)細(xì)胞（血管外膜）?！闭撐耐ㄓ嵶髡咧坏闹袊?guó)科學(xué)院生物物理研究所研究員劉光慧介紹,，遺傳增強(qiáng)的人類血管干細(xì)胞有望成為老弱血管“修補(bǔ)劑”，幫助修復(fù)衰老及受損血管,，未來(lái)可能被應(yīng)用于心肌梗死,、缺血性中風(fēng)等疾病的治療中。
腺病毒載體介導(dǎo) 選用“非主流”編輯器
提到基因編輯,，CRISPR/Cas9技術(shù)名聲在外,，它與ZFN、TALEN技術(shù)并稱為基因編輯“三大利器”,。但此次選用的基因編輯技術(shù)卻并不是其中之一,，而是被稱為輔助病毒依賴的腺病毒載體（HDAdV）介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)。
這個(gè)一口氣讀不下來(lái)的名字需要拆分來(lái)理解,。腺病毒載體是這款“基因編輯器”有效的核心,，它能被細(xì)胞“吞”進(jìn)去，并不會(huì)止步于細(xì)胞質(zhì),，卻能夠進(jìn)入到細(xì)胞核中,，因?yàn)橐獙?duì)基因進(jìn)行編輯、改寫、擦除等等操作,，必須走進(jìn)基因的“大本營(yíng)”細(xì)胞核中,。
然而腺病毒載體會(huì)保持在染色體外，并不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中,，這樣不會(huì)對(duì)人類基因組造成損傷。
“我們使用的是第三代腺病毒載體,，缺失了腺病毒的基因組序列,，因此大大降低了病毒載體的毒性?！眲⒐饣壅f(shuō),，可以理解為，經(jīng)過(guò)技術(shù)改造,，只保留了腺病毒“裝卸貨”的功能,，而它的病毒特性已經(jīng)完全擯棄了。
當(dāng)“HDAdV腺病毒號(hào)”貨車攜帶的DNA同源重組序列進(jìn)入細(xì)胞核后,，會(huì)自動(dòng)完成基因組靶序列的搜索和置換工作,。“HDAdV技術(shù)完全利用超大片段DNA同源重組的原理進(jìn)行基因編輯,，一般不會(huì)造成如CRISPR/Cas9一樣的脫靶效應(yīng),。”劉光慧介紹,，它可攜帶長(zhǎng)達(dá)25—37kb的超長(zhǎng)DNA片段進(jìn)入人類細(xì)胞核,，置換基因組的固有片段，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)高效精準(zhǔn)的基因編輯,。
技術(shù)越用越純熟,，劉光慧研究組對(duì)HDAdV技術(shù)的應(yīng)用研究已經(jīng)積累多年。早在2011年,，劉光慧等利用HDAdV基因編輯技術(shù)首次在人類疾病干細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了致病基因突變的高效精準(zhǔn)矯正,。研究組研究生顏鵬澤接受采訪時(shí)表示，CRISPR/Cas9技術(shù)才剛剛問(wèn)世,、尚沒(méi)有在人類細(xì)胞中應(yīng)用時(shí),，實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)熟練利用HDAdV技術(shù)矯正或敲入了若干種人類致病基因突變。同時(shí)也多番證明HDAdV基因編輯技術(shù)的安全性,，相關(guān)文章發(fā)表于《自然》《科學(xué)》《細(xì)胞》和《細(xì)胞干細(xì)胞》等雜志,。2017年，研究組更是通過(guò)HDAdV技術(shù)產(chǎn)生了國(guó)際上首例遺傳增強(qiáng)的人類間充質(zhì)干細(xì)胞,。
編輯FOXO3基因 它是長(zhǎng)壽界“名門閨秀”
工欲善其事,、必先利其器。有了趁手的技術(shù)和精巧的技藝，要使得血管細(xì)胞“年輕化”,，應(yīng)該對(duì)哪段基因?qū)嵤┚庉嬆兀?/p>
“FOXO3是最保守的,、也是公認(rèn)的與長(zhǎng)壽相關(guān)的基因?！眲⒐饣壅f(shuō),，F(xiàn)OXO家族是一類轉(zhuǎn)錄因子，在上世紀(jì)90年代,，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)FOXO家族同源蛋白可能參與了動(dòng)物壽命的調(diào)控,。
隨著研究的深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)FOXO3基因與人類長(zhǎng)壽的確相關(guān),。更進(jìn)一步的研究精細(xì)到單個(gè)核苷酸,。基本思路是,，將百歲長(zhǎng)壽老人群體的FOXO3基因與平均壽命78.5歲的老人對(duì)比,，找到這個(gè)區(qū)域內(nèi)的核苷酸變異，逐步縮小與長(zhǎng)壽直接相關(guān)的位點(diǎn)范圍,。更進(jìn)一步的研究表明,，許多國(guó)家地區(qū)的人在FOXO3基因中都能找到長(zhǎng)壽相關(guān)的核苷酸變異。
研究組決定對(duì)FOXO3基因進(jìn)行編輯,，還由于它能發(fā)揮“一石二鳥”的作用,。干細(xì)胞應(yīng)用于人體其實(shí)有著很高的難度，猶如平衡“蹺蹺板”,，干細(xì)胞的狀態(tài)必須恰到好處,，如果太“瘋狂”可能成為腫瘤，如果太“弱小”有可能由于是外來(lái)細(xì)胞被機(jī)體消滅,。
“研究發(fā)現(xiàn),，F(xiàn)OXO3具有維持血管穩(wěn)態(tài)的功能?！眲⒐饣壅f(shuō),，它本身是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，能激活下游的多個(gè)細(xì)胞保護(hù)的信號(hào)通路,，F(xiàn)OXO3的活化還可通過(guò)誘導(dǎo)抑癌基因表達(dá)抵抗腫瘤形成,，因此選擇FOXO3能同時(shí)提高細(xì)胞治療的效率和安全性。
為了證明這一點(diǎn),，研究組還將多種致癌因子導(dǎo)入了遺傳增強(qiáng)的血管細(xì)胞中,，發(fā)現(xiàn)它也可以有效抵抗癌基因誘導(dǎo)的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，這大大降低了利用這些細(xì)胞進(jìn)行治療的安全隱患,，使得干細(xì)胞向臨床應(yīng)用邁向了堅(jiān)實(shí)的一步,。
是“節(jié)流”不是“開源” 調(diào)控細(xì)胞運(yùn)轉(zhuǎn)“管理層”
FOXO3基因編碼的FOXO3蛋白，實(shí)質(zhì)是一種轉(zhuǎn)錄因子。它的工作地點(diǎn)是細(xì)胞核內(nèi),，通過(guò)與基因的特定序列專一性結(jié)合,，保證基因表達(dá)“有秩序”“有規(guī)律”。形象地說(shuō),，它們是細(xì)胞生命運(yùn)轉(zhuǎn)中的“管理層”,。
細(xì)胞內(nèi)部對(duì)“管理層”也有“彈劾”制度。在一定狀態(tài)下,，比如細(xì)胞感到“吃飽喝足”了,，就會(huì)通過(guò)PI3K/AKT通路磷酸化修飾FOXO3蛋白，讓這種蛋白打上磷酸化的“標(biāo)簽”,，隨后這些FOXO3蛋白就被“奪權(quán)”了，活性被抑制,，最終“下臺(tái)”被請(qǐng)出細(xì)胞核,。
“了解了這樣的調(diào)控機(jī)制，我們選擇了‘節(jié)流’而不是‘開源’,?！眲⒐饣壅f(shuō)，為了對(duì)基因組改動(dòng)最小,，研究組并不增強(qiáng)FOXO3基因表達(dá),，而是通過(guò)2個(gè)堿基的置換保證FOXO3蛋白不被“彈劾”而且“連任”。
“我們使用HDAdV介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)置換了人胚胎干細(xì)胞中FOXO3基因的第3號(hào)外顯子中的兩個(gè)單核苷酸,，使FOXO3蛋白轉(zhuǎn)錄因子不能有效地被AKT磷酸化,，從而抑制了FOXO3蛋白的磷酸化和降解，促進(jìn)FOXO3在細(xì)胞核內(nèi)的聚集進(jìn)而激活下游‘有益’靶基因的表達(dá),。通過(guò)對(duì)人類基因組中的兩個(gè)核苷酸進(jìn)行精準(zhǔn)編輯,，最大限度地保持了人類基因組的完整性?！眲⒐饣壅f(shuō),。
經(jīng)過(guò)基因編輯的干細(xì)胞被定向分化為不同的遺傳增強(qiáng)型人類血管細(xì)胞后，進(jìn)行了相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),。實(shí)驗(yàn)表明,，小鼠腿部大動(dòng)脈血管處被人為結(jié)扎后，向腿部輸送血液的道路就被封住了,。把遺傳增強(qiáng)的血管細(xì)胞注射到腿部后,，與注入未經(jīng)過(guò)遺傳增強(qiáng)的未經(jīng)基因編輯的血管細(xì)胞的對(duì)照組相比，前者有著更強(qiáng)的自我更新,、抵抗氧化損傷及延緩細(xì)胞衰老等能力,，可高效促進(jìn)受損血管再生，迅速恢復(fù)缺血部位血流。
