回顧分子生物學(xué)的發(fā)展歷程,，PCR技術(shù)的發(fā)明和普及無(wú)疑是最重要的篇章之一,。而PCR技術(shù)在近20年的不斷發(fā)展創(chuàng)新中,，最受矚目當(dāng)屬熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(real-time quantitative PCR, or qPCR)。定量PCR技術(shù)真正實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,，通過(guò)對(duì)PCR過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)控,，專一、靈敏快速,、可重復(fù)地精確定量起始模版濃度,，已經(jīng)在科研和臨床診斷領(lǐng)域得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。本文從熒光定量PCR的原理入手,，詳細(xì)介紹熒光定量PCR儀的類型和技術(shù),，為定量PCR儀的選擇提供詳細(xì)參考。
一,、背景
本來(lái),，PCR是為了將樣本中微量的DNA模版放大以便研究模版特性，隨著研究的深入,，要了解樣本中基因的表達(dá)模式與疾病的關(guān)系,，就需要了解標(biāo)本中的DNA原始拷貝數(shù)。理論上PCR過(guò)程中反應(yīng)產(chǎn)物是以指數(shù)規(guī)模增長(zhǎng)的,，但實(shí)際的PCR擴(kuò)增曲線并不是標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線,，而是S形曲線——因?yàn)殡S著PCR循環(huán)數(shù)的增加，擴(kuò)增規(guī)模迅速增大,，Taq酶,、dNTP、引物,，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求,，PCR的效率降低，產(chǎn)物生成的速度逐漸減緩,，最終進(jìn)入平臺(tái)期,。由于各種環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用，不同的PCR反應(yīng)體系進(jìn)入平臺(tái)期的時(shí)間和平臺(tái)期的高低都有很大變化,，即使是重復(fù)實(shí)驗(yàn),，各種條件基本一致,，最后得到的DNA拷貝數(shù)也往往不同。因此經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物量不能反映起始模板量的真實(shí)情況,。通過(guò)傳統(tǒng)凝膠電泳EB染色或者同位素標(biāo)記只能定量PCR的終產(chǎn)物量,，而不能定量起始DNA模版的拷貝數(shù)。
熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。借助于熒光信號(hào)來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物,，一方面提高了靈敏度,，另一方面可以在每次PCR循環(huán)收集數(shù)據(jù)，建立實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線,，準(zhǔn)確地確定域值循環(huán)數(shù)(CT值),，計(jì)算起始DNA拷貝數(shù)，做到了真正意義上的DNA定量,。根據(jù)最終得到的數(shù)據(jù)不同,，定量PCR可以分為相對(duì)定量和絕對(duì)定量?jī)煞N。相對(duì)定量常見(jiàn)于比較兩個(gè)樣本中基因表達(dá)水平的高低變化,，得到的結(jié)果是百分比,；絕對(duì)定量則需要使用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本中基因的拷貝數(shù)或濃度。
熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)最早是在1992年由一位日本人Higuchi第一次報(bào)告提出的,，他當(dāng)時(shí)的初衷很簡(jiǎn)單,，就是想實(shí)時(shí)地看到PCR反應(yīng)的整個(gè)過(guò)程，由于當(dāng)時(shí)EB（溴化乙錠）的廣泛使用,，最直接想到的標(biāo)記染料就是EB,，可以插入到雙鏈核酸中受激發(fā)光。這樣,，在普通PCR儀的基礎(chǔ)上再配備一個(gè)激發(fā)和檢測(cè)的裝置,，第一臺(tái)可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的PCR儀就誕生了。在PCR反應(yīng)的退火或延伸時(shí)檢測(cè)摻入到雙鏈核酸中EB的含量就能實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR反應(yīng)的進(jìn)程,，考慮到PCR反應(yīng)的數(shù)學(xué)函數(shù)關(guān)系,，結(jié)合相應(yīng)的算法，通過(guò)加入標(biāo)準(zhǔn)品的方法,，就可以定量待測(cè)樣品中的目標(biāo)基因。定量PCR技術(shù)的提出不單是PCR技術(shù)的飛躍,，也DNA定量技術(shù)的一次飛躍,。經(jīng)過(guò)不斷發(fā)展完善，到1996年當(dāng)時(shí)的PE公司（后來(lái)的ABI）推出了世界第一臺(tái)商品化的熒光定量PCR儀,，標(biāo)記方法也由最初的染料法,，逐漸發(fā)展到了特異性更高的Taqman探針?lè)?，以及Molecular Beacon、Fret等不同方法的標(biāo)記探針,。由于ABI公司在PCR領(lǐng)域的領(lǐng)袖地位和推動(dòng)定量PCR技術(shù)的早期發(fā)展的特殊貢獻(xiàn),， Taqman探針?lè)ǖ玫綇V泛使用。
