二,、常用熒光標(biāo)記方法

常用的熒光標(biāo)記方法可簡單分為兩大類：1.非特異檢測——雙鏈DNA內(nèi)插式熒光染料,；2.擴(kuò)增序列專一檢測——主要指熒光探針和引物探針。熒光染料技術(shù)成本低廉,，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡便,；而探針雜交技術(shù)在原理上嚴(yán)格，所得數(shù)據(jù)特異性高,、更為精確,。在選擇實(shí)驗(yàn)方案時(shí)要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shù)據(jù)精度的要求來決定。

非特異性檢測擴(kuò)增序列的代表是SYBR Green I熒光染料,。SYBR Green I只與DNA雙鏈結(jié)合,，插入DNA雙鏈時(shí)發(fā)出熒光；DNA雙鏈解鏈時(shí)釋放出來,，熒光信號急劇減弱,。在一個(gè)加入過量SYBR green 1熒光染料的體系內(nèi)，其信號強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量,。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過程是：1,、開始反應(yīng)，當(dāng)SYBR Green染料與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光,。2,、DNA變性時(shí)，SYBR Green染料釋放出來,，熒光急劇減少,。3、在聚合延伸完成后,，SYBR Green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大,。SYBR Green I 的最大吸收波長約為497nm,，發(fā)射波長最大約為520nm。

熒光染料的優(yōu)勢在于能監(jiān)測各種雙鏈DNA序列的擴(kuò)增,，無需設(shè)計(jì)探針,，檢測簡單簡便，成本低廉,。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合,，對DNA模板沒有選擇性,，因此它也能與非特異的dsDNA（如引物二聚體）結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)容易產(chǎn)生假陽性信號,，引物二聚體的問題目前可以用帶有熔解曲線（melting curve）分析的軟件加以解決,。要想用熒光染料法得到比較好的定量結(jié)果，對PCR引物設(shè)計(jì)的特異性和PCR反應(yīng)的質(zhì)量要求就比較高,。

熒光探針法是用序列特異的熒光標(biāo)記探針來檢測產(chǎn)物,，探針法的出現(xiàn)使得定量PCR技術(shù)的特異性比常規(guī)PCR技術(shù)大大提高。目前較常提及的有TaqMan探針,、FRET雜交探針(熒光共振能量傳遞探針)和分子信標(biāo)Molecular Beacon,。

廣泛使用的TaqMan探針法是指PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)另外加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針只與模板特異性地結(jié)合,，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間,。探針的5′端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R)，如FAM,、VIC等,，3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher, Q)，如TAMRA等,。當(dāng)探針完整的時(shí)候,，5′端報(bào)告基團(tuán)經(jīng)儀器光源激發(fā)的熒光正好被近距離的3′端熒光基團(tuán)淬滅，儀器檢測不到5′端報(bào)告基團(tuán)所激發(fā)的熒光信號（就是說5’熒光基團(tuán)的發(fā)射波長正好是3’ 熒光基團(tuán)的吸收波長,，因而能量被吸收傳遞到3’熒光基團(tuán)而發(fā)出其它熒光）,。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針,，其5′-3′外切酶活性（此活性是雙鏈特異性的,，游離的單鏈探針不受影響）就會將切割探針，釋放5′端報(bào)告基團(tuán)游離于反應(yīng)體系中,，遠(yuǎn)離3′端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽,，5′端報(bào)告基團(tuán)受激發(fā)所發(fā)射的熒光信號就可以被探頭檢測到。也就是說每擴(kuò)增一條DNA鏈,，就有一個(gè)熒光分子形成,，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。報(bào)告信號的強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù),。

Taqman探針檢測的是積累熒光,。常用的熒光基團(tuán)有FAM，TET,，VIC,，HEX等等。當(dāng)探針完整的時(shí)候,，由于3′端的熒光淬滅基團(tuán)在吸收5′端報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量,，本身會發(fā)射波長不同的熒光而導(dǎo)致本底高,，因此TaqMan探針近來又有新的發(fā)展——TaqMan MGB探針。MGB探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)(Non-Fluorescent Quencher),，本身不產(chǎn)生熒光,，可以大大降低本底信號的強(qiáng)度。同時(shí)探針上還連接有MGB (Minor Groove Binder)修飾基團(tuán),，可以將探針的Tm值提高10°C左右,。因此為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè)計(jì)得更短,，既降低了合成成本,，也使得探針設(shè)計(jì)的成功率大為提高——因?yàn)樵谀０宓腄NA堿基組成不理想的情況下，短的探針比長的更容易設(shè)計(jì),。實(shí)驗(yàn)證明,，TaqMan MGB探針對于富含A/T的模板可以區(qū)分得更為理想。

Taqman探針法已經(jīng)得到廣泛使用,，不過有人認(rèn)為這種技術(shù)利用了Taq酶5`—3`外切酶活性,，一般試劑廠家只給Taq酶的聚合酶活性定標(biāo)，沒有同時(shí)給Taq酶5`—3`外切酶活性定標(biāo),，不同批號試劑之間會給定量帶來差異,。另外對探針的熔點(diǎn)溫度(Tm)僅要求其高于60°C，這就使不同試劑盒之間的特異性參差不齊,，難于做質(zhì)控檢測,。

FRET探針是羅氏的專利，又稱雙雜交探針,，F(xiàn)RET探針由兩條相鄰探針組成,，在上游探針的3`端標(biāo)記供體熒光基團(tuán)（例如FAM），下游探針的5`端標(biāo)記受體熒光基團(tuán)（如Red 640）,。當(dāng)PCR變性時(shí)兩探針處于游離狀態(tài),，供體熒光分子受激發(fā)產(chǎn)生的熒光因?yàn)榫嚯x遠(yuǎn)而不能被受體熒光基團(tuán)吸收，受體熒光基團(tuán)不發(fā)光,，探頭就檢測不到指定波長熒光,。當(dāng)PCR退火時(shí)，兩探針同時(shí)結(jié)合在模板上,，供體基團(tuán)和受體熒光素相鄰,，供體熒光素受激發(fā)而產(chǎn)生的熒光正好被鄰近的受體熒光基團(tuán)吸收而發(fā)出另一波長的熒光，檢測探頭所檢測的正是這個(gè)受體基團(tuán)發(fā)射的熒光,，這個(gè)過程稱為熒光能量共振傳遞（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）,。由于FRET探針是靠近發(fā)光,，所以檢測信號是實(shí)時(shí)信號,，而非累積信號。FRET探針由于是雙雜交探針,，特異性更高,，但是成本也比較高。另外還可利用熒光寡核苷酸熔解曲線（melting curve）對與寡核苷酸探針結(jié)合的序列進(jìn)行分析,，從中獲取有用的信息,。常用的熒光基團(tuán)是：LC-Red640，LC-Red705,。

分子信標(biāo)（molecular beacon）是一類能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(或者叫莖環(huán)結(jié)構(gòu))的探針,，序列兩末端序列互補(bǔ)（5—8bp左右），中間環(huán)一般為15-30個(gè)核苷酸長,，并與目標(biāo)序列互補(bǔ),。探針一端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)，另一端結(jié)合淬滅基團(tuán),，當(dāng)探針游離呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí),，結(jié)合在其兩端的熒光基團(tuán)距離上接近，報(bào)告基團(tuán)激發(fā)的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收而使檢測探頭無法檢測到,。當(dāng)互補(bǔ)序列出現(xiàn)時(shí),，探針與DNA雜交，探針轉(zhuǎn)變成一個(gè)開放的線性結(jié)構(gòu),，報(bào)告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)彼此在空間上產(chǎn)生足夠的分離,，熒光基團(tuán)脫離了淬滅基團(tuán)的影響，從而產(chǎn)生可被檢測到的熒光,。分子信標(biāo)探針要求特定結(jié)構(gòu)的序列,，設(shè)計(jì)時(shí)必須非常仔細(xì)——在復(fù)性溫度下，模板不存在時(shí)形能成莖環(huán)結(jié)構(gòu),，模板存在時(shí)則與模板配對,。并非所有模版都能找到合適的分子信標(biāo)探針序列。

不過這個(gè)概念引申出來就產(chǎn)生了熒光標(biāo)記引物——把熒光基團(tuán)標(biāo)記的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列直接與PCR引物相結(jié)合,，使引物同時(shí)起到熒光探針的作用,，從而使熒光標(biāo)記基團(tuán)直接摻入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中。蝎子引物(scorpion primers)和Amplifluor引物都是在這個(gè)設(shè)計(jì)的延伸,。蝎子引物由分子信標(biāo)探針與一段引物序列連接而成,。在未雜交狀態(tài)下，探針由于自身配對形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),，使熒光淬滅,。在PCR反應(yīng)過程中，隨著引物的延伸,，探針與新合成鏈上的靶序列進(jìn)行分子內(nèi)雜交,，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開,，產(chǎn)生熒光信號。由此熒光信號的變化即可對原始模板進(jìn)行定性或定量分析,。Amplifluor系統(tǒng)使用一個(gè)通用的引物,，包含一個(gè)18堿基的序列(“Z 序列”)，“Z 序列”互補(bǔ)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),，并標(biāo)有熒光基團(tuán)與淬滅劑,。在目標(biāo)序列的一對特異性引物其中一個(gè)5’端加有Z序列，用這對引物擴(kuò)增目標(biāo)序列時(shí),，通用引物與Z序列配對并進(jìn)行擴(kuò)增,，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的打開，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離,，因此發(fā)射的熒光信號的強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量成正比,。使用這類引物不需要專門設(shè)計(jì)探針，也不要求模版具有特定的序列,，即省了成本又給實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了寬松的條件,。當(dāng)然由于省略了特異性探針，其專一性不如熒光探針法,。