一,、PCR概述
1、什么是PCR
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction,，簡稱PCR）又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù),。 由美國科學(xué)家PE（Perkin Elmer珀金-埃爾默）公司遺傳部的Dr. Mullis發(fā)明，由于PCR技術(shù)在理論和應(yīng)用上的跨時代意義,，因此Mullis獲得了1993年化學(xué)諾貝爾獎,。
2、PCR技術(shù)發(fā)展史
PCR原理是由一對引物介導(dǎo),，能在動植物體外對特定基因(DNA)片斷進(jìn)行快速酶促擴(kuò)增,，經(jīng)過n個熱循環(huán)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中所含特定基因數(shù)是原始模板數(shù)的(1+E)n(0＜E＜1,擴(kuò)增效率＝n倍)使得檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中的特定基因成為可能,。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)自從1993年到現(xiàn)在很快經(jīng)歷了四代產(chǎn)品：
第一代：手動/機(jī)械手式水浴基因擴(kuò)增
用三個恒溫水浴箱,，分別將三個水浴溫度恒定在三個溫度：PCR的高溫變性溫度（如94℃）低溫復(fù)性溫度（如58℃），適溫延伸溫度（如72℃）,。再用一個裝有PCR標(biāo)本試管的提籃,，用手工在不同溫度的水浴箱中依次水浴，標(biāo)本在每個水浴箱中恒溫的時間用秒表計(jì)時,。
這種方法的特點(diǎn)是：實(shí)驗(yàn)人員勞動強(qiáng)度大,，容易因疲勞引起差錯；而優(yōu)點(diǎn)是:設(shè)備簡單,，投資少,，與自動化基因擴(kuò)增儀相比，它無須升降溫過程,，實(shí)驗(yàn)時間短,，試驗(yàn)更接近理想PCR反應(yīng)條件,，但由于標(biāo)本試管從一個水浴箱往另一個水浴箱移動中要較短暫暴露于空氣中，因此如移動速度不夠快時也會對標(biāo)本形成溫度干擾,，影響結(jié)果。本方法的另外一些缺點(diǎn)包括只能局限三個溫階（某些PCR反應(yīng)需要多于三個溫階）,、液體污染以及在低氣壓地區(qū)水溫難以燒到94℃變性溫度等,。
為改進(jìn)提高本方法的自動化水平，有人設(shè)計(jì)了機(jī)械手裝置,，替代上述手工移動標(biāo)本過程,，形成了機(jī)械手水浴式基因擴(kuò)增儀，該改進(jìn)解決了實(shí)驗(yàn)人員的高強(qiáng)度勞動問題,，但又帶來了一個機(jī)械手部件大行程頻繁相對運(yùn)動而引起的高故障,。這種類型的基因擴(kuò)增儀在九十年代中期我國北京、上海有定型的產(chǎn)品銷售,，應(yīng)用也較廣,，曾為我國的分子生物學(xué)的發(fā)展做出過積極貢獻(xiàn)，而后便逐步被自動化程度更高的擴(kuò)增儀替代,，現(xiàn)在很少有單位使用,。
第二代：自動化控制型定性基因擴(kuò)增儀
與上述水浴式擴(kuò)增儀相比，也有人稱該種擴(kuò)增儀為干式基因擴(kuò)增儀,，它是最具代表性的擴(kuò)增儀,，包括后續(xù)介紹的第三代、第四代都是以第二代為基礎(chǔ)集成了定量檢測部分,。
第三代：終點(diǎn)定量/半定量
第二代的定性PCR只能定性,，而無法評價特定核酸的濃度及定量分析，定量PCR至少能達(dá)到定性PCR無法實(shí)現(xiàn)的下列功能： •潛伏期病毒濃度探測 •感染程度 •致病病原體數(shù)量變化測定 •抗病毒藥物療效評估 •恢復(fù)期病毒載量檢測,。
自從1996年美國ABI公司發(fā)明第一臺熒光定量PCR儀以來,，PCR技術(shù)和應(yīng)用從定性向定量快速發(fā)展，終點(diǎn)定量PCR的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備投資少,，對于國內(nèi)經(jīng)濟(jì)條件還不能購買昂貴實(shí)時熒光定量PCR儀的科研單位和醫(yī)療機(jī)構(gòu),，利用現(xiàn)有的第二代常規(guī)定性PCR儀，在添加一臺專用的單孔PCR終點(diǎn)產(chǎn)物熒光定量檢測儀便可開始工作,，起到定量的作用,。終點(diǎn)定量PCR技術(shù)是從定性向?qū)崟r定量過渡的一個中間產(chǎn)品，但現(xiàn)在進(jìn)口的終點(diǎn)定量PCR
第四代：實(shí)時定量PCR
實(shí)時定量QPCR儀＋實(shí)時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析軟件,，構(gòu)成PCR-DNA/RNA實(shí)時熒光定量檢測系統(tǒng),。
設(shè)備由熒光定量系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)組成，用來監(jiān)測循環(huán)過程的熒光,。與實(shí)時設(shè)備相連的計(jì)算機(jī)收集熒光數(shù)據(jù),。數(shù)據(jù)通過開發(fā)的實(shí)時分析軟件以圖表的形式顯示,。原始數(shù)據(jù)被繪制成熒光強(qiáng)度相對于循環(huán)數(shù)的圖表。原始數(shù)據(jù)收集后可以開始分析,。實(shí)時設(shè)備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行正?；幚韥韽浹a(bǔ)背景熒光的差異。正?；罂梢栽O(shè)定域值水平,，這就是分析熒光數(shù)據(jù)的水平。樣品到達(dá)域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值（限制點(diǎn)的循環(huán)數(shù)）,。域值應(yīng)設(shè)定在使指數(shù)期的擴(kuò)增效率為最大,，這樣可以獲得最準(zhǔn)確，可重復(fù)性的數(shù)據(jù),。如果同時擴(kuò)增的還有標(biāo)有相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,，線性回歸分析將產(chǎn)生一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以用來計(jì)算未知樣品的濃度,。
二,、PCR技術(shù)的應(yīng)用
1、分子生物學(xué)研究：
現(xiàn)在PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的研究,，可以說是分子生物實(shí)驗(yàn)室的一項(xiàng)非常常規(guī)的技術(shù)手段,。它常被用于基因表達(dá)研究、新藥開發(fā)研究等領(lǐng)域,。
特別是熒光實(shí)時定量PCR儀,，可應(yīng)用于針對一些感染性疾病的藥物，如各種病毒病,、細(xì)菌病等,，在新藥的開發(fā)過程中，快速了解藥物對疾病進(jìn)程的影響可以為新藥開發(fā)節(jié)約大量的人力,、時間和資金,，與以前所用的Elisa等方法相比，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)可以快速,、準(zhǔn)確,、定量、靈敏地測定血液或組織中病原體的含量,，因此有利用分析藥物的作用效果,，為比較不同的配方的療效、用藥量,、用藥時間等等提供快速,、定量的評價。此方法除了用于人用藥物以外,，還可以用于畜用藥物,，甚至其他經(jīng)濟(jì)動物及植物的藥物研究等,，因此其在藥物研究方面的應(yīng)用范圍是很廣的。另外,，實(shí)時熒光定量PCR方法可測定血液中病毒核酸的含量,，因此不必等到病人體內(nèi)產(chǎn)生抗體，同時,，由于其靈敏度與Elisa相比不可同日而語,，在病毒感染的早期，即血液中病毒含量很低時就可以測定,，為將疾病消滅在超早期作出貢獻(xiàn)。而對于一些已經(jīng)上市的新藥或是應(yīng)用了很長時間的老藥,，其用藥的效果以及用藥量及用藥時間都可以進(jìn)行進(jìn)一步的研究,，為更加合理化的應(yīng)用這些藥物為人類造福進(jìn)行進(jìn)一步的研究。以前所用的方法由于不能準(zhǔn)確定量,，靈敏度也不夠,，因此有很多需要研究的內(nèi)容沒有完成。這一方面需要研究內(nèi)容很多,，意義也很大,。
2、醫(yī)療方面的應(yīng)用：
⑴ 病原體檢測：目前,，采用熒光定量PCR檢測技術(shù)可以對淋球菌,、沙眼衣原體、解脲支原體,、人類乳頭瘤病毒,、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒,、肝炎病毒,、流感病毒、結(jié)核分枝桿菌,、EB病毒和巨細(xì)胞病毒等病原體進(jìn)行定量測定,。與傳統(tǒng)的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少,、快速簡便等優(yōu)點(diǎn),。
⑵ 產(chǎn)前診斷：到目前為止，人們對遺傳性物質(zhì)改變引起的遺傳性疾病還無法治療,，只能通過產(chǎn)前監(jiān)測,，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發(fā)生,，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生,，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA,，用實(shí)時熒光定量PCR檢測其Y性別決定區(qū)基因是一種無創(chuàng)傷性的方法，易為孕婦所接受,。
⑶ 藥物療效考核：對乙型肝炎病毒 (HBV),、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析顯示：病毒量與某些藥物的療效關(guān)系。HCV高水平表達(dá),，干擾素治療作用不敏感,，而HCV低滴度，干擾素作用敏感,；在拉米夫定治療過程中,，HBV-DNA的血清含量曾有下降，隨后若再度上升或超出以前水平,，則提示病毒發(fā)生變異,。
⑷ 腫瘤基因檢測：盡管腫瘤發(fā)病的機(jī)理尚未清楚，但相關(guān)基因發(fā)生突變是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因已被廣泛接受,。癌基因的表達(dá)增加和突變,，在許多腫瘤早期就可以出現(xiàn)。實(shí)時熒光定量PCR不但能有效地檢測到基因的突變,，而且可以準(zhǔn)確檢測癌基因的表達(dá)量,。隨著與腫瘤相關(guān)的新基因的不斷發(fā)現(xiàn)，熒光定量PCR技術(shù)將會在腫瘤的研究中發(fā)揮更大的作用,。
(5)在優(yōu)生優(yōu)育中的應(yīng)用：近年來經(jīng)濟(jì)發(fā)展迅猛,，人民生活水平逐年提高，對自身及家人特別是下一代的身體健康愈來愈重視,。另外,，由于國內(nèi)計(jì)劃生育工作逐步走向深化，獨(dú)生子女比較多,，孩子的身體素質(zhì)更成為長輩們關(guān)注的焦點(diǎn),。因此，怎樣提高新生兒質(zhì)量改善人類遺傳素質(zhì),，即優(yōu)生優(yōu)育已顯得非常重要,。以往對遺傳性疾病的檢測主要使用染色體分析法，而臨床絕大部分遺傳性疾病是基因病而不是染色體病,，染色體發(fā)析法不能檢出的,。若使用PCR基因擴(kuò)增法聯(lián)合單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析（sscp）、限制性片段長度多態(tài)性分析（RFCP）等位基因特異性寡核某酸（Aso）點(diǎn)雜交或差異PCR可以很方便地檢出單個基因的突變而且其準(zhǔn)確性可達(dá)95%以上,，因此使這一問題得到了較好的解決,。常見的易致胎兒畸型的感染性疾病原體主要有單皰病毒（HSVⅡ）、風(fēng)疹病毒（RV）、人巨細(xì)胞病毒（HCMV）,、弓形體（TOX）及沙眼衣原體（CT）,。以往這些病原體感染診斷比較困難，主要靠培養(yǎng)法進(jìn)行確診,，而培養(yǎng)法費(fèi)時,，代價昂貴，而且受到采樣,、樣本保存及用藥等因素的影響,，基本不能在臨床中推廣。PCR基因擴(kuò)增法因其高敏感性,、高特異性非常適合這些疾病診斷及療效跟蹤,，是最值得推薦的檢驗(yàn)方法。不管是否懷疑胎兒有嚴(yán)重遺傳病傾和中或有感染引起的畸形風(fēng)險,，對胎兒的去留應(yīng)尊重胎兒父母親的意見,。
(6)新的愈后指標(biāo)的研究：對于感染性疾病，在藥物作用至一定程度后,，就認(rèn)為可以停藥了,，但是應(yīng)該在什么停藥,，現(xiàn)在大都沒有一個明確的指標(biāo),，現(xiàn)在所用的指標(biāo)由于受到檢測方法的靈敏度及準(zhǔn)確性限制，這一指標(biāo)未必合理,，因此有必要對治愈的指標(biāo)以及指標(biāo)與復(fù)發(fā)率以及疾病轉(zhuǎn)化為其他疾病之間的關(guān)系等進(jìn)行進(jìn)一步的研究,，從而為藥物或療法徹底治愈疾病打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
(7)血液檢驗(yàn)漏檢率：由于實(shí)時熒光定量PCR方法比Elisa靈敏很多,，因此,，血站或血液研究所一般用來研究Elisa方法的漏檢率，即分析Elisa方法測定為陰性的血樣,，再用實(shí)時熒光定量PCR方法來復(fù)檢,。復(fù)檢時，一般24個Elisa陰性的血樣混合成一個樣本進(jìn)行檢測,。上海用此方法在用于血液制品的血液中發(fā)現(xiàn)一例HIV,，后經(jīng)測定供血者，證實(shí)病人的確是HIV陽性,。由于不同地區(qū)所用的Elisa試劑,、方法、批號等都不相同,，因此不同地區(qū)都有必要進(jìn)行這一工作,。
3、新診斷及檢驗(yàn)試劑的開發(fā)
現(xiàn)有的很多診斷及檢驗(yàn)方法都不能同時滿足快速,、靈敏,、定量的要求如現(xiàn)有培養(yǎng)法,、Elisa法等等，而熒光定量PCR方法以則可以做到這一點(diǎn),，從而可為臨床疾病,、商檢、糧油檢驗(yàn),、食品檢驗(yàn),、血液檢驗(yàn)等等開發(fā)新的試劑，從而提高檢驗(yàn)的靈敏度,、速度及準(zhǔn)確性等,；這類試劑的種類是非常多的，所開發(fā)的試劑的社會效益及經(jīng)濟(jì)效益都是很巨大的,。
由于PCR法尤其是熒光定量PCR方法的快速,、靈敏、定量的特點(diǎn),，其在研究及開發(fā)方面的應(yīng)用是不勝枚舉的,，如研究個人基因型與藥物療效之間的關(guān)系等；研究人員也可以根據(jù)自已研究項(xiàng)目開發(fā)其新的用途,。
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