中國生物技術信息網2005年5月8日訊 生物芯片是指包被在硅片,、尼龍膜等固相支持物上的高密度的組織、細胞,、蛋白質,、核酸、糖類以及其它生物組分的微點陣,。芯片與標 記的樣品進行雜交,，通過檢測雜交信號即可實現(xiàn)對生物樣品的分析。目前常見的生物芯片主要有基因芯片,，,，蛋白質芯片、組織芯片等,?；?芯片也可以叫做 reverse northern - dot blots。目前主要有檢測基因突變的基因芯片和檢測基因表達水平的基因表達譜芯片,。基因芯片技術 主要包括芯片微陣列制備,、樣品制備,、雜交、信號的檢測和分析等,。蛋白質芯片主要是蛋白質如抗原或抗體在載體上的有序排列,，依據蛋白質 分子、蛋白質與核酸相互作用的原理進行雜交,、檢測和分析,。從不同的組織內進行活體解剖后取出圓柱狀的組織，然后包埋在受體區(qū)組內,，這樣的石蠟塊集成體便構成了組織芯片,。
1 生物芯片的應用
1.1 檢測基因的表達
　　目前檢測基因表達的方法主要有Northern、RT- PCR,、mRNA差異顯示,、cDNA代表性差異分析等,。這些方法都只能對少數幾個基因的表達 進行分析。但生物體是一個復雜的網絡,，任何一個刺激都會牽動網絡的許多環(huán)節(jié),。只對少數幾個基因的表達進行研究顯然是不夠的。生物芯片 技術恰好能夠從整個基因組水平上對某一刺激或疾病進行檢測,。例如,，Bittner M等對8150個基因進行檢測。發(fā)現(xiàn)了皮膚黑素瘤的亞種,。Zhang W等發(fā)現(xiàn)類胰島素生長因子結合蛋白2(IGFBP2)在神經膠質瘤和惡性膠質瘤的后期階段表達量很大,，且差異很大。Gu J等對患有ankylosing spondylitis(AS),、類風濕性關節(jié)炎(RA)和正常人的外周血單核細胞(PBMC)的基因表達進行分析后發(fā)現(xiàn),，患有AS的病人與患有 RA的病人的PBMC 表達模式差異很大，且極不正常,。Tanaka F等用芯片分析后發(fā)現(xiàn)了在FAO和C2細胞系之間表達有差異的基因,，并從扣除文庫中用抑制扣除雜交的 方法分離到了一個cDNA克隆，該克隆在C2內的表達強于在FAO內的表達,。Nakeff A等用一定濃度的XK469對結腸細胞HCT-116處理24小時后,，再與 芯片雜交，結果發(fā)現(xiàn)在1152個基因中,，有71個基因的表達量變化超過2倍以上,。
1.2 研究生物體對逆境的反應
　　Ronchen Wang等用生物芯片對擬南芥在低氮(250μM)和高氮(5～lOmM)條件下基因表達的差異做了分析后發(fā)現(xiàn)，表達差異的基因不僅包 括以前已經報道過的基因如硝酸還原酶,、硝態(tài)氮轉運蛋白等,，還發(fā)現(xiàn)了許多新的受低氮誘導表達的基因如鈣離子反向運輸因子、蛋白激酶以及 與代謝有關的酶(如轉酮酶,、天冬酰胺合成酶,、組胺酸脫羧酶等)。Motoaki Seki等發(fā)現(xiàn),，擬南芥受旱脅迫和冷脅迫后,，在1300個全長cDNA中， 有44個受旱脅迫誘導,，19個受冷脅迫的誘導,，有12個是控制脅迫誘導轉錄因子DREB1A/CBF3的靶向誘導基因。 Shinji Kawasaki等發(fā)現(xiàn),，水稻受 150mM Nacl脅迫15分鐘后,，Paokkali的轉錄受到正調控，大約１小時后,，約有10％的基因受到顯著的正調控或負調控,，在對照株和試驗株之間 基因表達的差異可延續(xù)數小時,，但差異越來越不明顯，一周后基本無差異,。Oliver Thimm等發(fā)現(xiàn)擬南芥幼苗缺鐵3天后,，參與糖酵解、三羧酸循 環(huán),、氧化戊糖磷酸途徑的基因以及在根中參與無氧呼吸的酶的基因表達量增加,，苗中參與葡糖異生作用、淀粉分解,、韌皮部裝載的基因也受到 誘導表達,。
1.3 研究生物體對光線的反應
　　Ligeng Ma等發(fā)現(xiàn)，擬南芥幼苗被遠紅光,、紅光和藍光分別照射后,，表達相似的調節(jié)基因基本占到整個基因組的三分之一，其中五分之 一的基因受到正調控,，五分之二的基因受到負調控,，共有26個細胞途徑參與了光調節(jié)。Yukako Hihara等發(fā)現(xiàn),，當改變對單細胞藍藻細菌Synechocystis sp PCC6803光合器官照射的光強時,，共有160多個基因的表達出現(xiàn)了差異，那些參與光呼吸和光化學反應的基因在強光照射15分鐘后受到負調控 ,，而與二氧化碳固定和受到光抑制保護的基因則受到正調控,，那些表達有利于細胞增殖的基因如參與復制、轉錄,、翻譯的基因也受到誘導表達 ,，不過反應較晚。Robert Schaffer等發(fā)現(xiàn)擬南芥在18小時光照／6小時黑暗處理的條件下,，在代表了7800個無重復基因的11521個EST片段中,， 有11％的基因表達出現(xiàn)了差異，有2％的基因表現(xiàn)出有規(guī)律的變化,。
　　除了上述的幾個方面外,，生物芯片在細菌鑒定,、環(huán)境檢測,、發(fā)現(xiàn)新基因等各個領域也有著廣闊的應用前景。

2 生物芯片技術的最新研究進展
2.1 微珠芯片的發(fā)展
　　生物芯片技術目前比較顯著的一個研究進展是微珠芯片的研制,。其原理是先建立tag文庫和anti-tag文庫,，在體外將不同的cD NA克隆后 ，附著在不同的微珠上,，微珠在系統(tǒng)內流動,，在流動的過程中與被標記上特定顏色的探針雜交,，攜帶特定顏色的微珠被掃描下來，進而研究基 因的表達,。
2.2 在微量mRNA的檢測技術方面的進展
　　以前一般認為,，生物芯片技術對RNA的量有一定的要求，每次雜交一般需要50～200mg total RNA或1～2mg mRNA,，要求有較多的材料,。 但有時我們只能獲得較少的材料，例如研究蠅或蠕蟲的微小器官,。這對生物芯片技術提出了更高的要求,，而Hertzberg等用靶標簽擴增的方法進 行分析，只需0.1 μg total RNA即可滿足要求,。其原理是提取RNA后,，反轉錄為cDNA，然后將cDNA剪切為200～600bp長的片段,，篩選cDNA3'端 ,，用PCR擴增的方法獲得足夠量的cDNA，再去進行芯片分析,。用多輪線性擴增的方法同樣可對來自500～1000個細胞的RNA或者1～50 mg的total RNA進行分析,。Karsten SL等用 TSA的方法也可以從少量組織內提取RNA進行分析。
2.3 檢測結果處理技術的進展
　　如何消除芯片背景對于結果分析的影響,，例如因各個操作環(huán)節(jié)的原因,，芯片沾有污染物，芯片的最后結果實際上是污染物和真實信號的 綜合體現(xiàn),，所以當用芯片上的這些結果進行分析時,，哪些點是可靠的，哪些點的表達確實有差異,，不同實驗室,、不同操作人員作出的結果如何 進行統(tǒng)一化、標準化,，對此 Jiang L等認為,，盡管生物芯片的結果存在著人為因素影響，特別是那些表達量低,、差異不明顯的基因,。但是這些 誤差可以通過傳統(tǒng)的蛋白質分析技術如酶譜、western blot,、雙向電泳,、免疫組織化學等進行驗證。他們從同一心臟組織內取樣后用這幾種技 術分析后都得到了相似或互補的結果,。Kenneth R． Hess等采用smoothed estimate of the interquartile range的方法研究后認為,，在+/- 3XIQR曲線以外的點都是不可用的,，不同實驗室之間的結果比較可以用一個或一組(多于75個)持家基因的表達量作為標準。Jason Comander等研 制的芯片處理軟件可以辨別結果的真?zhèn)?，并能夠計算芯片上各基因表達的強度?，F(xiàn)在已經有一部分類似的軟件。最近對生物芯片實驗數據的分 析處理的研討會在Duke大學舉行,，并對處理這類數據的一系列方法作了評價,。
2.4 蛋白質芯片的研究
　　Heng Zhu等克隆了5800個酵母的開放閱讀框，表達并純化了相應的蛋白質,，將這些蛋白質固定在芯片上,，做成酵母的蛋白質組芯片，對 芯片進行分析后發(fā)現(xiàn)了許多新的與鈣調蛋白,、磷脂互作的蛋白,。發(fā)現(xiàn)一個普通的蛋白結合域竟是許多鈣調蛋白的結合位點。這是目前為止第一 個生物的全蛋白質組芯片,。

3 未來的發(fā)展趨勢
　　生物芯片在近幾年發(fā)展極為迅速,，但它也面臨著巨大的挑戰(zhàn)，主要體現(xiàn)在以下幾個方面,。
　　(1)所需費用較高,。目前生物芯片設備所需費用仍舊較高，如Affymetrix的一套系統(tǒng)需要13.5萬美元,，對普通的實驗室來說開支較大,， 這對于生物芯片技術的推廣是一個很大的障礙。
　　(2)自動化程度不高,。目前生物芯片技術對操作人員仍要求較高,，每個實驗室都需要一個專門的技術人員去建立并操作。如何提高生物 芯片實驗的自動化程度,，簡化操作步驟,，使其縮微化，將生物芯片的各個操作環(huán)節(jié)集中到一個或少數幾個儀器里邊,，就像目前的PCR儀那樣,，使 那些即使對生物芯片技術不甚熟悉的人也可以操作，這將是生物芯片技術未來的一個重要的發(fā)展方向,。
　　(3)目前,，對于實驗的許多結果還不能做出完美的解釋。這將依賴于生物學的整體發(fā)展,，這也促進了人們對生物學進行更深層次的研究 ,。
　　(4)對結果的掃描,、去除背景,、數據處理等,，目前還不能作得很完美。但隨著一大批硬件,、軟件的開發(fā),，相信這些問題都將會被克服。

　　生物芯片技術盡管存在著上面所說的巨大挑戰(zhàn),，但生物芯片技術仍將是2l世紀極為重要的一項生物技術,。隨著各國研究者的不斷努力， 它必將在更大的范圍得到應用,。