RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù),。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA,，再以cDNA為模板,，擴(kuò)增合成目的片段,。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛,，可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平,，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列,。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物,。無論使用何種RNA,，關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。8 K9 w1 j- r2 v4 Q+ Z8 r! G4 Y" B1 f
RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù),。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA,，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段,。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛,，可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列,。作為模板的RNA可以是總RNA,、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。,。RT-PCR用于對(duì)表達(dá)信息進(jìn)行檢測或定量,。另外，這項(xiàng)技術(shù)還可以用來檢測基因表達(dá)差異或不必構(gòu)建cDNA文庫克隆cDNA,。RT-PCR比其他包括Northern印跡,、RNase保護(hù)分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù),，更靈敏,，更易于操作。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶,，以隨機(jī)引物,、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始,。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中,，每一步都在最佳條件下進(jìn)行,。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR,。在一步法RT-PCR中,，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時(shí)為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進(jìn)行,。逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶,，至少具有以下三種活性：
1、依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈,；7 x0 u; C& v) X& C
2,、Rnase水解活性：水解RNA雜合體中的RNA；7 Z. u$ t ^$ X: Z' G
3,、依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA.用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇隨機(jī)引物,、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。對(duì)于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA,，三種都可,。( s:
RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù),。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA,，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段,。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛,，可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列,。作為模板的RNA可以是總RNA,、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。,。RT-PCR用于對(duì)表達(dá)信息進(jìn)行檢測或定量,。另外，這項(xiàng)技術(shù)還可以用來檢測基因表達(dá)差異或不必構(gòu)建cDNA文庫克隆cDNA,。RT-PCR比其他包括Northern印跡,、RNase保護(hù)分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù),，更靈敏,，更易于操作。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶,，以隨機(jī)引物,、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始,。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中,，每一步都在最佳條件下進(jìn)行,。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR,。在一步法RT-PCR中,，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時(shí)為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進(jìn)行,。逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶,，至少具有以下三種活性：
1、依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈,；7 x0 u; C& v) X& C
2,、Rnase水解活性：水解RNA雜合體中的RNA；7 Z. u$ t ^$ X: Z' G
3,、依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA.用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇隨機(jī)引物,、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。對(duì)于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA,，三種都可,。( s:
