凝膠成像系統(tǒng)的基本骨包含:CCD相機(jī),,暗室和分析軟件,。不過其功能不僅僅限于對瓊脂糠凝膠進(jìn)行成像,,現(xiàn)在的成像儀趨向于多功能化,還適用于蛋白膠,、發(fā)熒光的膠,、印跡膜和菌落平板等應(yīng)用。在Western Blot方面,,高性能的CCD分子成像系統(tǒng)能與膠片媲美,。
(1)、分辨率
分辨率的大小和像素值是分不開的,,像素指得是CCD能分別的最小的感光元件,,我們平時(shí)說的多少萬像素就是這些感光元件的個(gè)數(shù)了。所以一般來講像素越多,,成像也就越清晰細(xì)膩,,當(dāng)然這其中還要受許多因素限制,下面會慢慢提到的,。但是高像素也不一定是好的CCD,,其原因就是像素大小(Pixel Size),,也是很重要的因素,,相同數(shù)目的像素,排列越密集,,像素之間就越容易出現(xiàn)電流干擾,,容易出現(xiàn)"噪點(diǎn)"等干擾成像質(zhì)量的現(xiàn)象出現(xiàn)。由于制造工藝的限制,,增加尺寸,,成本將會以幾何級數(shù)提高。
現(xiàn)在大部分廠家的CCD為了提高圖像的靈敏度,,會使用像素合并的技術(shù),,那么像素合并的意義是什么呢?
像素合并是一種非常有用的功能,它可被用來提高像素的大小和靈敏度,,如圖所示分辨率為795512,,像素大小為9u,當(dāng)經(jīng)過22合并后,變成398256,,像素大小為18u.33合并后,,變成265170,像素大小為27u,靈敏度提高9倍,,這樣每個(gè)像素大小為27u.
(2),、動態(tài)范圍值
動態(tài)范圍表示在一個(gè)圖像中最亮與最暗的比值。
灰階表示在一種表征光亮度的方法,,12bit表示從最暗到最亮等分為212=4096個(gè)級別,,16bit即分為216個(gè)級別,可見bit值越高能分出的細(xì)微差別越大,,如圖下面這張圖片人眼只能分辨出40個(gè)灰階,,而對于一臺12bit的儀器能分辨出4,096個(gè)灰階。值得一提的是,,目前來說,,市場上主流的凝膠成像的CCD以12bit為主,16bit的儀器一般情況下,,分辨率均在200萬像素左右,,對于真正的16bit,而像素值又近400萬的CCD是非常少見的,。
12bit與16bit在圖像分辨上的區(qū)別
對動態(tài)范圍進(jìn)行量化需要一個(gè)運(yùn)算公式,,即動態(tài)范圍值 = 20 log (well depth/read noise),其中Well depth代表是滿井電子,,是CCD飽和時(shí)能接受的電子信號總值,,read noise是讀出噪聲(以電子數(shù)來表示),每個(gè)CCD在讀數(shù)的過程中都會產(chǎn)生噪聲,,噪聲越小,,監(jiān)測靈敏度越高。其中滿井電子與CCD的bit值是相關(guān)的,,通常下,,bit值越高,滿井電子的數(shù)值越大,。
舉例如下:
Well depth = 85,000 個(gè)電子, read noise = 12 個(gè)電子
Dynamic range = 20 log (85,000/12), or 77dB.
動態(tài)范圍的值越高CCD性能越好.
(3),、量子效率
CCD的量子效率也稱像素靈敏度,指在一定的曝光量下,像素勢阱中所積累的電荷數(shù)與入射到像素表面上的光子數(shù)之比,。不同結(jié)構(gòu)的CCD其量子效率差異很大,。比如100光子中積累到像素勢阱中的電荷數(shù)是50個(gè),則量子效率為50%(100 photons = 50 electrons means 50% efficiency)。值得注意的是CCD 的量子效率與入射光的波長有關(guān),。
(4),、信噪比
說到信噪比就不得不提到暗電流了,暗電流是導(dǎo)致CCD噪音的很重要的因素,。暗電流指在沒有曝光的情況下,,在一定的時(shí)間內(nèi),CCD傳感器中像素產(chǎn)生的電荷,。我們在做化學(xué)發(fā)光檢測的時(shí)候,,需要的曝光的時(shí)候比較長,,這樣導(dǎo)致CCD產(chǎn)生較多的暗電流,,對圖像的質(zhì)量影響非常大。通常情況下通過降低CCD的溫度來最大限度的減少暗電流對成像的影響,。下圖表明了暗電流與溫度的關(guān)系,,從圖中我們可以看出,CCD產(chǎn)生的暗電流隨著溫度下降而減少,,但是在-23℃下曲線開始趨于平緩,,由此可以看出溫度并非需要無休止的降低的。所以在選擇冷CCD時(shí),,溫度在-25℃(絕對溫度,,非室溫以下)下一般就可以達(dá)到您的要求了。
有的CCD是在圖像最終生成后,,通過軟件去背景來扣除暗電流,,對于信號遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于背景的有一定效果,但是對于弱信號處理過程中會產(chǎn)生越來越多的錯(cuò)誤,。
以上是關(guān)于CCD的原理和影響因素的一些介紹,,
(5)光學(xué)鏡頭
光學(xué)鏡頭是機(jī)器視覺系統(tǒng)中必不可少的部件,直接影響成像質(zhì)量的優(yōu)劣,,影響算法的實(shí)現(xiàn)和效果,。光學(xué)鏡頭規(guī)格繁多,有時(shí)不免頭暈,。光學(xué)鏡頭從焦距上可分為短焦鏡頭,、中焦鏡頭,長焦鏡頭,;從視場大小分有廣角,、標(biāo)準(zhǔn),遠(yuǎn)攝鏡頭,;結(jié)構(gòu)上分有固定光圈定焦鏡頭,,手動光圈定焦鏡頭,自動光圈定焦鏡頭,手動變焦鏡頭,、自動變焦鏡頭,,自動光圈電動變焦鏡頭,電動三可變(光圈,、焦距,、聚焦均可變)鏡頭等。
(6)濾光鏡片
熒光:EB ,、TLC plates,、GFP plates、SYBR Green,、SYBR Gold,、SYBR Safe、SYPRO Red,、SYPRO Orange,、Texas Red、Rhodamine Red,、Fluorescein,、Deep Purple、Cy2,、Cy3,、Cy3.5、Cy5,、熒光板等(要根據(jù)具體的激發(fā)光源和濾鏡來決定)
光源 激發(fā)波長 吸收波長 染料
Blue 475nm 537nm SYBR Green,、SYBR Gold、SYBR Safe,、SYPRO Orange,、Cy2等
Green 534nm 606nm SYPRO Red、Cy3等
Red 632nm 609nm Texas Red,、Rhodamine Red ,、Cy5等
(7)、數(shù)據(jù)傳輸
IEEE1394總線是一種目前為止最快的高速串行總線,,火線(IEEE1394)支持的傳輸速率有100Mbps,200Mbps,,400Mbps,最高的傳輸速度為400Mbps/s,。對于各種需要大量帶寬的設(shè)備提供了專門的優(yōu)化,,接口可以同時(shí)連接63個(gè)不同設(shè)備,IEEE1394同USB一樣,,支持帶電插撥設(shè)備,。IEEE1394同樣支持即插即用,,現(xiàn)在的WIN98 SE、WIN2000,、WIN ME,、WIN XP都對IEEE1394支持的很好,在這些操作系統(tǒng)中用戶不用再安裝驅(qū)動程序,,也能使用IEEE1394設(shè)備,。