三,、定量原理

定量PCR可以實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR的全過(guò)程，為了準(zhǔn)確定量和計(jì)算,，取PCR反應(yīng)的前半段指數(shù)擴(kuò)增期數(shù)據(jù),。因?yàn)闄z測(cè)的是熒光信號(hào)，首先需設(shè)定一個(gè)域值(threshold)作為熒光本底信號(hào)(baseline),。從擴(kuò)增曲線(xiàn)上可以看到,，在初始的若干個(gè)循環(huán)，由于熒光信號(hào)變化弱而一直在本底基線(xiàn)附近波動(dòng),。當(dāng)檢測(cè)到的熒光信號(hào)超過(guò)域值,，就被認(rèn)為是真正的信號(hào)，它可用于定義樣本的域值循環(huán)數(shù)(Ct)——PCR擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù),。實(shí)驗(yàn)操作中,，Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),。

顯然，CT值取決于域值,。域值的量化定義是基線(xiàn)范圍內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍,。實(shí)驗(yàn)操作中，域值范圍定義是從第3個(gè)循環(huán)起到CT值前3個(gè)循環(huán)止,，其終點(diǎn)要根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)的具體數(shù)據(jù)調(diào)整(前2個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)太弱,，扣除背景后的校正信號(hào)往往波動(dòng)比較大；而在CT值前3個(gè)循環(huán)大多數(shù)情況下熒光信號(hào)已經(jīng)開(kāi)始增強(qiáng),，超過(guò)了基線(xiàn)高度),。從圖1的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中可以直觀地看到，隨著PCR反應(yīng)過(guò)程,，熒光信號(hào)從基線(xiàn)經(jīng)一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)進(jìn)入指數(shù)期,、線(xiàn)性期和最終的平臺(tái)期，盡管平臺(tái)期DNA拷貝數(shù)波動(dòng)很大,，CT值卻是相對(duì)固定的,。如果用不同濃度模版DNA作PCR，可以看出模版濃度越高,，CT值越小,。模版濃度每增加1倍，CT值減小1個(gè)循環(huán),。CT值與模板DNA的起始拷貝數(shù)成反比,。這一結(jié)論可以從數(shù)學(xué)上嚴(yán)格證明。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù),。

模板定量可分為相對(duì)定量和絕對(duì)定量,。絕對(duì)定量指的是用已知量的標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)推算未知的樣本的量。質(zhì)粒DNA常作為絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備之用,。標(biāo)準(zhǔn)品的量可根據(jù)260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量來(lái)轉(zhuǎn)換成其拷貝數(shù)來(lái)確定,。相對(duì)定量指的是在樣本中目標(biāo)序列相對(duì)于另一參照樣本的量的變化。即參照物是1*的樣本,，其它的樣本為參照物量的n倍,。可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法或者比較CT法進(jìn)行相對(duì)定量,，前者和絕對(duì)定量相似,，后者運(yùn)用了數(shù)學(xué)公式來(lái)計(jì)算相對(duì)量，前提是假設(shè)每個(gè)循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物數(shù)量,，在PCR反應(yīng)的指數(shù)期得到CT值來(lái)反應(yīng)起始模板的量,，一個(gè)循環(huán)（CT=1）的不同相當(dāng)于起始模板數(shù)2倍的差異,。但是此方法是以靶基因和內(nèi)參照的擴(kuò)增效率基本一致為前提的，效率的偏移將影響實(shí)際拷貝數(shù)的估計(jì),。

無(wú)論絕對(duì)定量還是相對(duì)定量,，在得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，還要考慮數(shù)據(jù)之間的可比性問(wèn)題,。在實(shí)驗(yàn)操作中,，取樣都是以體積或重量為單位的，但是同樣體積或重量的樣本所來(lái)源的細(xì)胞數(shù)目并不一樣,，所以拷貝/μL或拷貝/ng的定量數(shù)據(jù)相互之間實(shí)際上并不可比,。只有將這些數(shù)據(jù)歸一到以拷貝/細(xì)胞或拷貝/基因組為單位后，才可進(jìn)行嚴(yán)格意義上的比較,。這種校正可以通過(guò)適當(dāng)?shù)膮⒈葋?lái)完成,。參比一般選用b-actin、GAPDH,、rRNA基因等管家基因,。由于它們?cè)诩?xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)是恒定的，受環(huán)境因素影響較小,，其定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組的數(shù)量,。為了減少誤差，目標(biāo)基因和參比基因最好在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)進(jìn)行定量測(cè)定,，所以這種對(duì)照稱(chēng)為陽(yáng)性?xún)?nèi)對(duì)照(Internal Positive Control,，IPC)。要進(jìn)行IPC歸一化校正,，定量PCR儀必須具備多色檢測(cè)能力,，最好是4色。否則,，目標(biāo)基因和參比基因只能分兩管作定量,，就不成其為“內(nèi)”標(biāo)了。

定量實(shí)驗(yàn)與定性實(shí)驗(yàn)最大的不同,，是要考慮統(tǒng)計(jì)學(xué)要求并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的校正,，以消除偶然誤差。因此重復(fù)實(shí)驗(yàn)和設(shè)立各種對(duì)照非常重要,。這一點(diǎn)在實(shí)踐中往往被輕視或忽視,。定量實(shí)驗(yàn)，誤差是不可避免的,。設(shè)立重復(fù)實(shí)驗(yàn),，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，可以將誤差降低到最小,。所以定量實(shí)驗(yàn)的每個(gè)樣本至少要重復(fù)3次以上,，嚴(yán)格的定量更應(yīng)當(dāng)重復(fù)6～8次,，以滿(mǎn)足小樣本統(tǒng)計(jì)的要求。 如果作絕對(duì)定量,，則標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)需要在5個(gè)點(diǎn)以上,。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)使用的標(biāo)準(zhǔn)品是濃度已知的DNA樣本，雖然可以自己制備,，為標(biāo)準(zhǔn)化以及發(fā)表文章起見(jiàn)最好購(gòu)買(mǎi)商品化的標(biāo)準(zhǔn)品,。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的反應(yīng)條件應(yīng)當(dāng)與樣本完全一致，以便準(zhǔn)確定量,。