目前可開(kāi)展的血栓/止血成份檢測(cè)的主要方法有凝固法,、底物顯色法,、免疫法,、乳膠凝集法等,。在表1中可注意到,，在血栓/止血檢驗(yàn)中最常用的凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）,、纖維蛋白原（FIB）,、凝血酶時(shí)間（TT）、內(nèi)源凝血因子,、外源凝血因子,、高分子量肝素、低分子量肝素,、蛋白C,、蛋白S等均可用凝固法測(cè)量。所以目前半自動(dòng)血凝儀基本上都是以凝固法測(cè)量為主,，而在全自動(dòng)血凝儀中也一定有凝固法測(cè)量,。
凝固法中又可分為光學(xué)法和磁珠法兩類。由于光學(xué)法幾乎可涵蓋各種檢測(cè)方法,，為了降低儀器制造成本,，全自動(dòng)血凝儀以光學(xué)法居多。但也有少數(shù)高級(jí)全自動(dòng)血凝儀中凝固法測(cè)量采用無(wú)樣品干擾的雙磁路磁珠法,，而其它測(cè)量采用光學(xué)法,，并可同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。
一,、 凝固法（生物物理法）
凝固法是通過(guò)檢測(cè)血漿在凝血激活劑作用下的一系列物理量的變化（光,、電、機(jī)械運(yùn)動(dòng)等）,，由計(jì)算機(jī)分析所得數(shù)據(jù)并將之換算成最終結(jié)果,，所以也可將其稱作生物物理法。
1. 電流法
電流法利用纖維蛋白原無(wú)導(dǎo)電性而纖維蛋白具有導(dǎo)電性的特點(diǎn),，將待測(cè)樣品作為電路的一部分,，根據(jù)凝血過(guò)程中電路電流的變化來(lái)判斷纖維蛋白的形成。
由于該電流法的不可靠性及單一性,，很快被更靈敏,、更易擴(kuò)展的光學(xué)法所淘汰,。
2. 光學(xué)法（比濁法）
光學(xué)式血凝儀是根據(jù)凝固過(guò)程中濁度的變化來(lái)測(cè)定凝血的。根據(jù)不同的光學(xué)測(cè)量原理,，又可分為散射比濁法和透射比濁法兩類,。
測(cè)定項(xiàng)目
凝固法
底物顯色法
乳膠凝集法
ELISA
凝血酶原時(shí)間（PT）
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活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）
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凝血酶時(shí)間（TT）
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纖維蛋白原（FIB）
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外源性凝血因子II、V,、VII,、X
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●
內(nèi)源性凝血因子VIII、IX,、XI,、XII
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凝血因子VIII
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肝素
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低分子量肝素
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抗凝血酶III（AT-III）
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蛋白C（PC）
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蛋白S（PC）
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血栓調(diào)節(jié)蛋白（Thromodulin）
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活化蛋白C抵抗性（APC-R）
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纖溶酶原（PLG）
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α2抗纖溶酶（α2-AP）
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補(bǔ)體1脂酶抑制物（CI）
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組織纖溶酶原激活物（t-PA）
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纖溶酶原激活物抑制物（PAI）
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纖維蛋白單體
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纖維蛋白降解產(chǎn)物（FDP）
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D-二聚體（D-Dimer）
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纖維蛋白肽A（FPA）
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凝血酶原斷片1+2（F1+2）
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表1 血栓/止血成份檢測(cè)方法
（1）散射比濁法：散射比濁法（圖1）是根據(jù)待驗(yàn)樣品在凝固過(guò)程中散射光的變化來(lái)確定檢測(cè)終點(diǎn)的。在該方法中檢測(cè)通道的單色光源與光探測(cè)器呈90°直角,，當(dāng)向樣品中加入凝血激活劑后,隨著樣品中纖維蛋白凝塊的形成過(guò)程,，樣品的散射光強(qiáng)度逐步增加，儀器把這種光學(xué)變化描繪成凝固曲線,，當(dāng)樣品完全凝固以后,，散射光的強(qiáng)度不再變化。通常是把凝固的起始點(diǎn)作為0%,，凝固終點(diǎn)作為100%,，把50%作為凝固時(shí)間。光探測(cè)器接收這一光的變化,，將其轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，經(jīng)過(guò)放大再被傳送到監(jiān)測(cè)器上進(jìn)行處理,，描出凝固曲線,。當(dāng)測(cè)定含有干擾物（高脂血癥、黃疸和溶血）或低纖維蛋白原血癥的特殊樣本時(shí),，由于本底濁度的存在,，其作為起始點(diǎn)0%的基線會(huì)隨之上移或下移，儀器在數(shù)據(jù)處理過(guò)程中用本底扣除的方法來(lái)減少了這類標(biāo)本對(duì)測(cè)定的影響,。但是這是以犧牲有效信號(hào)的動(dòng)態(tài)范圍為代價(jià)的,，對(duì)于高濁度標(biāo)本并不能有效解決問(wèn)題。
（2）透射比濁法：透射比濁法（圖2）是根據(jù)待測(cè)樣品在凝固過(guò)程中吸光度的變化來(lái)確定凝固終點(diǎn),。與散射比濁法不同的是該方法的光路同一般的比色法一樣呈直線安排：來(lái)自光源的光線經(jīng)過(guò)處理后變成平行光,，透過(guò)待測(cè)樣品后照射到光電管變成電信號(hào)，經(jīng)過(guò)放大后在監(jiān)測(cè)器處理,。當(dāng)向樣品中加入凝血激活劑后,，開(kāi)始的吸光度非常弱，隨著反應(yīng)管中纖維蛋白凝塊的形成,，標(biāo)本吸光度也逐漸增強(qiáng),，當(dāng)凝塊完全形成后,，吸光度趨于恒定。血凝儀可以自動(dòng)描記吸光度的變化并繪制曲線,，設(shè)定其中某一點(diǎn)對(duì)應(yīng)的時(shí)間為凝固時(shí)間,。
就濁度測(cè)量原理而言，散射比濁法更為合理,、準(zhǔn)確,。在這類儀器中，光源,、樣品,、接收器成直角排列，接收器得到的完全是濁度測(cè)量所需的散射光,。
而在透射比濁法中,，光源、樣品,、接收器成一直線排列,，接收器得到的是很強(qiáng)的透射光和較弱的散射光，前者是有效成份,，后者應(yīng)扣除,，所以要進(jìn)行信號(hào)校正，并按經(jīng)驗(yàn)公式換算到散射濁度,。此法雖儀器簡(jiǎn)單,，但精度較差。
在上述的設(shè)計(jì)中都是吸光度從弱變強(qiáng),，而有的產(chǎn)品設(shè)計(jì)正好相反——吸光度從強(qiáng)變?nèi)酢?br />
例如在“光電磁珠法”的設(shè)計(jì)中,，在待測(cè)樣本中加入具有一定濁度的試劑和一粒鋼珠，鋼珠在磁場(chǎng)的作用下起攪拌作用,，樣本在凝固過(guò)程中產(chǎn)生的纖維蛋白絲不斷纏繞于鋼珠上,，使液體反而逐漸變清，吸光度值逐漸降低,。該方法重復(fù)性好,，監(jiān)測(cè)范圍大（可以監(jiān)測(cè)結(jié)果超高和低纖維蛋白原的各種異常血漿），但是由于仍以監(jiān)測(cè)吸光度變化為依據(jù),，所以無(wú)法從根本上解決溶血,、高脂血癥或乳糜微粒、渾濁等干擾物對(duì)檢測(cè)的影響,。
光學(xué)法凝血測(cè)試的優(yōu)點(diǎn)在于靈敏度高,、儀器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于自動(dòng)化，缺點(diǎn)是樣品的光學(xué)異常,、測(cè)試杯的光潔度,、加樣中的氣泡等都會(huì)成為測(cè)量的干擾因素。針對(duì)光學(xué)法血凝儀遇到有較高初始濁度的樣品就無(wú)能為力的弱點(diǎn),，不同型號(hào)的光學(xué)法血凝儀采取了各種不同的措施,。例如，有的用本底扣除的百分濁度法,，這對(duì)中,、低初始濁度有補(bǔ)償作用，而不能解決高濁度樣品的測(cè)試,；又如,，有的利用一階微分的峰值作為凝固終點(diǎn)，但微分處理會(huì)引起重復(fù)性變差,。
3. 雙磁路磁珠法:
早期的是在檢測(cè)杯中放一粒磁珠,，與杯外一根鐵磁金屬桿緊貼呈直線狀，標(biāo)本凝固后,，由于纖維蛋白的形成,，使磁珠移位而偏離金屬桿，儀器據(jù)此檢測(cè)出凝固終點(diǎn),。這類儀器也可稱為平面磁珠法,。早期的平面磁珠法雖能有效克服光學(xué)法中樣品本底干擾的問(wèn)題，但也存在著靈敏度低等問(wèn)題,。
現(xiàn)代磁珠法在八十年代末提出,、九十年代初商品化。現(xiàn)代磁珠法曾形象地稱為擺動(dòng)磁珠法,，不過(guò)雙磁路磁珠法的名稱更為確切,。
雙磁路磁珠法的測(cè)試原理（圖3）如下：測(cè)試杯兩側(cè)的有一組驅(qū)動(dòng)線圈，它們產(chǎn)生恒定的交替電磁場(chǎng),，使測(cè)試杯內(nèi)特制的去磁小鋼珠保持等幅振蕩運(yùn)動(dòng)。凝血激活劑加入后,，隨著纖維蛋白的產(chǎn)生增多,，血漿的粘稠度增加，小鋼珠的運(yùn)動(dòng)振幅逐漸減弱,，儀器根據(jù)另一組測(cè)量線圈感應(yīng)到小鋼珠運(yùn)動(dòng)的變化,，當(dāng)運(yùn)動(dòng)幅度衰減到50%時(shí)確定凝固終點(diǎn)。
雙磁路磁珠法進(jìn)行凝血測(cè)試,，完全不受溶血,、黃疸及高血脂癥的影響，甚至加樣中產(chǎn)生氣泡也不會(huì)影響測(cè)試結(jié)果,。
光學(xué)法血凝儀的試劑用量只有手工測(cè)量的一半,。而磁珠法的試劑用量只有光學(xué)法的一半,！這是因?yàn)樵诒葷釡y(cè)定過(guò)程中，激發(fā)光束必須打在測(cè)試杯的中間,，所以要有足夠的試劑量,。在雙磁路磁珠法測(cè)量中，鋼珠在測(cè)試杯的底部運(yùn)動(dòng),，因此試劑只要覆蓋鋼珠運(yùn)動(dòng)即可,。
雙磁路磁珠法中的測(cè)試杯和鋼珠都是專利技術(shù)，有特殊要求,。測(cè)試杯底部的弧線設(shè)計(jì)與磁路相關(guān),，直接影響測(cè)試靈敏度。小鋼珠經(jīng)過(guò)多道工藝特殊處理,，完全去掉磁性,。在使用過(guò)程中，加珠器應(yīng)遠(yuǎn)離磁場(chǎng),，避免鋼珠磁化,。為了保證測(cè)量的正確性，鋼珠應(yīng)當(dāng)一次性使用,。
血凝儀的測(cè)量過(guò)程中,，充分?jǐn)嚢柚陵P(guān)重要，這對(duì)于凝血過(guò)程的描述和凝固終點(diǎn)的判斷都會(huì)有很大幫助,，CV會(huì)有很大改進(jìn),。在儀器中常用磁珠攪拌或離心方式來(lái)達(dá)到目的。現(xiàn)在有相當(dāng)一部分光學(xué)式半自動(dòng)血凝儀采用磁珠攪拌,。
二,、底物顯色法（生物化學(xué)法）
底物顯色法通過(guò)測(cè)定產(chǎn)色底物的吸光度變化來(lái)推測(cè)所測(cè)物質(zhì)的含量和活性的，該方法又可稱為生物化學(xué)法,。檢測(cè)通道由一個(gè)鹵素?zé)魹闄z測(cè)光源,，波長(zhǎng)一般為405nm。探測(cè)器與光源呈直線,，與比色計(jì)相仿,。
凝血儀使用產(chǎn)色底物檢測(cè)血栓與止血指標(biāo)的原理是：通過(guò)人工合成與天然凝血因子有相似的一段氨基酸排列順序并還有特定作用位點(diǎn)的小肽,并將可水解產(chǎn)色的化學(xué)基因與作用位點(diǎn)的氨基酸相連。測(cè)定時(shí)由于凝血因子具有蛋白不解酶的活性,，它不僅作用于天然蛋白質(zhì)肽鏈,，也能作用于人工合成的肽段底物，從而釋放出產(chǎn)色基因,，使溶液呈色,。產(chǎn)生顏色的深淺與凝血因子活性成比例關(guān)系，故可進(jìn)行精確的定量。目前人工合成的多肽底物有幾十種,，而最常用的是對(duì)硝基苯胺（PNA）,，呈黃色，可用405mm波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定,。
底物顯色法靈敏度高,、精密度好，而且易于自動(dòng)化,，為血栓/止血檢測(cè)開(kāi)辟了新途徑,。
底物顯色法通常使用以下三種形式：
a) 先將被檢血漿中的某種酶加以激活，然后由此活化的凝血因子對(duì)人工合成的底物進(jìn)行水解而呈色,，如纖溶酶原,，蛋白C測(cè)定等。
b) 向被檢血漿中加入過(guò)量的有關(guān)試劑,，以中和相應(yīng)的抗凝因子,，然后測(cè)定其殘余的酶活性，如AT-活性測(cè)定,，α2-抗纖溶酶測(cè)定,，肝素測(cè)定等。
以測(cè)定抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)為例,，在反應(yīng)體系中加入過(guò)量的凝血酶,，后者與血漿中的AT-Ⅲ形成1：1復(fù)合物，剩余凝血酶作用于合成的凝血酶底物S-2238（H-D-Phe-Pip-Arg-PNA·2Hcl）,，釋放出顯色基團(tuán)PNA,，顯色反應(yīng)的深淺與剩余凝血酶的量呈正相關(guān)，而與AT-Ⅲ的活性呈負(fù)相關(guān),。
c) 直接測(cè)定被檢血漿中某種蛋白水解酶的活性,，如凝血酶，Xa,，尿激酶測(cè)定等,。
三、免疫學(xué)方法
在免疫學(xué)方法中以純化的被檢物質(zhì)為抗原,，制備相應(yīng)的抗體,，然后用抗原抗體反應(yīng)對(duì)被檢物進(jìn)行定性和定量測(cè)定。常用方法有:
1．免疫擴(kuò)散法 將被檢物與相應(yīng)抗體在一定的介質(zhì)中結(jié)合,，測(cè)定其沉淀環(huán)的大小，與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較,，計(jì)算待測(cè)物的濃度,。此法操作簡(jiǎn)單，不需特殊設(shè)備，但耗時(shí)過(guò)長(zhǎng),，且靈敏度不高,，僅適于含量較高的凝血因子的檢測(cè)。
2． 火箭電泳 在一定電場(chǎng)中,，凝膠支持物內(nèi)的被檢測(cè)與其相應(yīng)抗體結(jié)合形成的一個(gè)個(gè)“火箭峰”,，火箭峰的高度與其含量成正比，通過(guò)測(cè)定峰高并與標(biāo)準(zhǔn)比較而進(jìn)行定量測(cè)定,。此法操作復(fù)雜,，臨床應(yīng)用較少。
3．雙向免疫電泳 通過(guò)水平與垂直兩個(gè)方向進(jìn)行電泳可將某些分子結(jié)構(gòu)異常的凝血因子進(jìn)行分離,。
4. 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA法）用酶標(biāo)抗原或抗體和被檢物進(jìn)行抗原結(jié)合反應(yīng),，經(jīng)過(guò)洗滌除去未結(jié)合的抗原或抗體及標(biāo)本中的干擾物質(zhì)，留下固定在管壁的抗原抗體復(fù)合物,，然后加入酶的底物和色原性物質(zhì),，反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)，用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定,，顏色的深淺與被檢物濃度呈比例關(guān)系,。該法靈敏度高，特異強(qiáng),，目前已用于許多止血,、血栓成分的檢測(cè)。
5．免疫比濁法 將被檢物與其相應(yīng)抗體混合形成復(fù)合物,，從而產(chǎn)生足夠大的沉淀顆粒,，通過(guò)透射比濁或散射比濁進(jìn)行測(cè)定。此法操作簡(jiǎn)便,，準(zhǔn)確性好,，便于自動(dòng)化。
免疫比濁法可分為直接濁度法分析和乳膠比濁法分析,。
直接濁度分析既可通過(guò)透射比濁,，也可通過(guò)散射比濁。
透射比濁是指凝血儀光源的光線通過(guò)待檢樣本時(shí),，由于待檢樣本中的抗原與其對(duì)應(yīng)的抗體反應(yīng)形成抗原-抗體復(fù)合物,，使透過(guò)的光強(qiáng)度減弱，其減弱程度與抗原量成一定的數(shù)量關(guān)系,，通過(guò)這一點(diǎn)可從透過(guò)光強(qiáng)度的變化來(lái)求得抗原的量,。
散射比濁法指凝血儀光源的光通過(guò)待測(cè)樣本時(shí)，由于其中的抗原與特異的抗體形成抗原-抗體復(fù)合物,，使溶質(zhì)顆粒增大,，光散射增強(qiáng),。散射光強(qiáng)度的變化與抗原的量呈一定的數(shù)量關(guān)系，通過(guò)這一點(diǎn)可從散射光強(qiáng)度的變化來(lái)求得抗原含量,。
另一種是乳膠比濁法,，即將將待檢物質(zhì)相對(duì)應(yīng)的抗體包被在直徑為15～60nm的乳膠顆粒上，然后與被檢物結(jié)合,，形成抗原抗體的復(fù)合物的乳膠顆粒凝集,，體積增大，使透射光和散射光的變化更為顯著,，從而提高實(shí)驗(yàn)的靈敏性,。用儀器或肉眼進(jìn)行定量或半定量分析。目前,，多用于FDP和D-二聚體的檢測(cè),。
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