(一)終點法(End point method)
根據(jù)反應(yīng)達(dá)到平衡時反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜特征及其吸光度大小，對物質(zhì)進(jìn)行定量分析的方法,。對一般化學(xué)反應(yīng)來說,，反應(yīng)完全(或正,、逆反應(yīng)動態(tài)平衡)、反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定時為反應(yīng)終點,。對抗原一抗體反應(yīng)來說,，是抗原和抗體完全反應(yīng)、形成最大且穩(wěn)定的免疫復(fù)合物時為終點,。在反應(yīng)時間進(jìn)程曲線上為與x軸平行線區(qū)段,。在測定計算方式上，一般分為一點法和兩點法兩種,。
1．一點法(One Point) 以試劑和樣品混合之前的空氣空白(GB),、水空白(WB)或試劑空白(RB)的吸光度值為測定計算基點，以反應(yīng)終點的吸光度讀數(shù)減去空白讀數(shù),，得到反應(yīng)吸光度,。通過與相同條件下校準(zhǔn)液反應(yīng)吸光度的比較，求得測定結(jié)果,。常與一點校準(zhǔn)法配合使用,，即采用一個校準(zhǔn)濃度,，校準(zhǔn)曲線通過零點且成線性。也應(yīng)用多點校準(zhǔn),。
2．兩點終點法(Two Point End)即終點一始點法 以試劑和樣品混合之后的某一時間點作為始點,，以反應(yīng)終點的吸光度讀數(shù)減去始點讀數(shù)。一定條件下可降低樣品對反應(yīng)或反應(yīng)本身的特異性于擾(主要指色度干擾),。常采用雙試劑,，多以加R2前某一點作測定始點；某些情況下,，也可以加R2后一點作測定始點,。若使用單試劑，主反應(yīng)啟動太快或儀器起始讀數(shù)點受限時難以運用,。
固定時間法(Fixed Method)與兩點終點法的區(qū)別只是在：測定讀數(shù)的末點不在反應(yīng)平衡區(qū)段,，而是根據(jù)方法學(xué)選擇。如血清肌酐(苦味酸法)測定,。
3．三點終點法 即雙終點法,，在一個通道內(nèi)一次進(jìn)行兩項反應(yīng)相關(guān)的終點法測定。比如同測游離脂肪酸和甘油三酯,。某些儀器(如HITACHI系列)設(shè)置此方法,。
(二)連續(xù)監(jiān)測法(Continuous monitoring method)
又稱速率法(Rate Assay)。即連續(xù)監(jiān)測反應(yīng)過程,，根據(jù)所測定的產(chǎn)物生成或底物消耗的速度進(jìn)行定量分析的方法,。在反應(yīng)時間進(jìn)程曲線上為反應(yīng)呈恒速區(qū)段(斜率保持不變)，常用于酶活性線性反應(yīng)期測定,。
1．連續(xù)監(jiān)測法即零級反應(yīng)速率法,，亦稱斜率法。在較長的反應(yīng)時間區(qū)段內(nèi)(至少90-120秒),，每隔一定時間(常為2~30秒)讀取一次吸光度值,，至少讀取4點，得到3個△A,；一般將連續(xù)多次讀數(shù)作最小二乘法處理,，讀數(shù)間隔時間太短的作帶速率時間(TR)多點法處理，均取線性反應(yīng)部分的讀數(shù),，求出單位時間內(nèi)的反應(yīng)速率△A/min,。此法必須以零級反應(yīng)為測定計算的基礎(chǔ)，因為只有在零級反應(yīng)下,，單位時間內(nèi)的吸光度變化(反應(yīng)速率△A/min)才與酶活力呈正比,。此法相對減少了分析誤差，大大提高了分析速度和準(zhǔn)確性,。但是,，半自動生化分析儀采用單樣品連續(xù)監(jiān)測,，相當(dāng)耗時。應(yīng)用連續(xù)監(jiān)測法,，首先應(yīng)準(zhǔn)備線性范圍內(nèi)的高,、中、低濃度的樣品,，分別作反應(yīng)時間進(jìn)程曲線,，了解不同濃度下反應(yīng)全過程，兼顧確定延遲時間和線性監(jiān)測期,。
2．兩點速率法即所謂擬一級速率法,。在反應(yīng)中選取兩時問點t 1、t 2,，讀取吸光度A 1,、A2，計算(A2-A1),，(t2-t1)=△A,，△t。此方法與終點兩點法的區(qū)別主要有兩點：后一讀數(shù)點反應(yīng)未達(dá)終點,，以速率計算結(jié)果,。它與連續(xù)監(jiān)測法比較，缺點在于人為確定t 1,、t 2,，不定因素較多,，不能保證反應(yīng)在t 1-t 2期間呈線性,，影響結(jié)果準(zhǔn)確性；應(yīng)在常規(guī)測定前,，先做預(yù)試驗來確定線性時間段,。若在選擇的時間段內(nèi)反應(yīng)不成線性(如零級反應(yīng)期短，儀器無法設(shè)置或測定),，則只能改用終點法,。優(yōu)點在于方法簡單；酶活力較低,、測定吸光度值較小時,，可增加測定時間段而不受儀器連續(xù)監(jiān)測時間點的局限，減少讀數(shù)誤差,。
3．速率B法在一個通道內(nèi)一次進(jìn)行兩項反應(yīng)相關(guān)的速率法測定,。它既可以是兩項試驗測定，也可用于干擾或／及樣品空白自動補償0后一用途的原理是：利用儀器的微機自動處理,，在第一反應(yīng)(干擾反應(yīng))一直維持線性的前提下,，可以從第二反應(yīng)(主反應(yīng))速率中扣除第一反應(yīng)速率的延續(xù)影響,。如用于消除膽紅素轉(zhuǎn)化為膽綠素吸光度下降、對肌酐苦味酸法測定的負(fù)干擾等,。某些儀器(如HITACHI系列)設(shè)置此方法,。
(三)空白(blank)校正
在分光光度法中，常利用空白溶液來調(diào)節(jié)儀器的吸光度零點,，或用來抵消某些測定的干擾因素,。在生化分析儀測定中，除了采用雙或多波長,、兩點法等排除背景干擾外,，常要運用專門空白測定，以便從樣品測定吸光度中扣除其影響,。正確選擇空白校正,，對提高準(zhǔn)確度起重要作用。
1．試劑空白一般在方法類型和校準(zhǔn)模式中,，即分為有或無試劑空白兩大類,。試劑空白單獨測定或與校準(zhǔn)配合測定，并需預(yù)選裝載去離子水樣品杯或試劑空白架,。校準(zhǔn)或病人樣品的各測定點吸光度,，均要扣除相應(yīng)測定點的試劑空白吸光度或空白速率值。無試劑空白的方法,，多直接以反應(yīng)杯的水空白作為測定基準(zhǔn)值,。
在不少儀器中，試劑空白測定類似校準(zhǔn)測定,，并非在病人樣品測定時實時測定,。所以，要注意它的測定頻率,，避免因試劑批號或質(zhì)量的變化造成試劑空白的改變引起的計算誤差,。
2.樣品空白 主要為了消除樣品本身混濁或色度的干擾。常采用空白通道法,，測定校正結(jié)果=顯色反應(yīng)通道結(jié)果-空白通道結(jié)果,。多數(shù)儀器須另外占用測定通道，分析速度減半,，但去干擾的準(zhǔn)確性應(yīng)高于兩點終點法,。
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根據(jù)反應(yīng)達(dá)到平衡時反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜特征及其吸光度大小，對物質(zhì)進(jìn)行定量分析的方法,。對一般化學(xué)反應(yīng)來說,，反應(yīng)完全(或正,、逆反應(yīng)動態(tài)平衡)、反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定時為反應(yīng)終點,。對抗原一抗體反應(yīng)來說,，是抗原和抗體完全反應(yīng)、形成最大且穩(wěn)定的免疫復(fù)合物時為終點,。在反應(yīng)時間進(jìn)程曲線上為與x軸平行線區(qū)段,。在測定計算方式上，一般分為一點法和兩點法兩種,。
1．一點法(One Point) 以試劑和樣品混合之前的空氣空白(GB),、水空白(WB)或試劑空白(RB)的吸光度值為測定計算基點，以反應(yīng)終點的吸光度讀數(shù)減去空白讀數(shù),，得到反應(yīng)吸光度,。通過與相同條件下校準(zhǔn)液反應(yīng)吸光度的比較，求得測定結(jié)果,。常與一點校準(zhǔn)法配合使用,，即采用一個校準(zhǔn)濃度,，校準(zhǔn)曲線通過零點且成線性。也應(yīng)用多點校準(zhǔn),。
2．兩點終點法(Two Point End)即終點一始點法 以試劑和樣品混合之后的某一時間點作為始點,，以反應(yīng)終點的吸光度讀數(shù)減去始點讀數(shù)。一定條件下可降低樣品對反應(yīng)或反應(yīng)本身的特異性于擾(主要指色度干擾),。常采用雙試劑,，多以加R2前某一點作測定始點；某些情況下,，也可以加R2后一點作測定始點,。若使用單試劑，主反應(yīng)啟動太快或儀器起始讀數(shù)點受限時難以運用,。
固定時間法(Fixed Method)與兩點終點法的區(qū)別只是在：測定讀數(shù)的末點不在反應(yīng)平衡區(qū)段,，而是根據(jù)方法學(xué)選擇。如血清肌酐(苦味酸法)測定,。
3．三點終點法 即雙終點法,，在一個通道內(nèi)一次進(jìn)行兩項反應(yīng)相關(guān)的終點法測定。比如同測游離脂肪酸和甘油三酯,。某些儀器(如HITACHI系列)設(shè)置此方法,。
(二)連續(xù)監(jiān)測法(Continuous monitoring method)
又稱速率法(Rate Assay)。即連續(xù)監(jiān)測反應(yīng)過程,，根據(jù)所測定的產(chǎn)物生成或底物消耗的速度進(jìn)行定量分析的方法,。在反應(yīng)時間進(jìn)程曲線上為反應(yīng)呈恒速區(qū)段(斜率保持不變)，常用于酶活性線性反應(yīng)期測定,。
1．連續(xù)監(jiān)測法即零級反應(yīng)速率法,，亦稱斜率法。在較長的反應(yīng)時間區(qū)段內(nèi)(至少90-120秒),，每隔一定時間(常為2~30秒)讀取一次吸光度值,，至少讀取4點，得到3個△A,；一般將連續(xù)多次讀數(shù)作最小二乘法處理,，讀數(shù)間隔時間太短的作帶速率時間(TR)多點法處理，均取線性反應(yīng)部分的讀數(shù),，求出單位時間內(nèi)的反應(yīng)速率△A/min,。此法必須以零級反應(yīng)為測定計算的基礎(chǔ)，因為只有在零級反應(yīng)下,，單位時間內(nèi)的吸光度變化(反應(yīng)速率△A/min)才與酶活力呈正比,。此法相對減少了分析誤差，大大提高了分析速度和準(zhǔn)確性,。但是,，半自動生化分析儀采用單樣品連續(xù)監(jiān)測,，相當(dāng)耗時。應(yīng)用連續(xù)監(jiān)測法,，首先應(yīng)準(zhǔn)備線性范圍內(nèi)的高,、中、低濃度的樣品,，分別作反應(yīng)時間進(jìn)程曲線,，了解不同濃度下反應(yīng)全過程，兼顧確定延遲時間和線性監(jiān)測期,。
2．兩點速率法即所謂擬一級速率法,。在反應(yīng)中選取兩時問點t 1、t 2,，讀取吸光度A 1,、A2，計算(A2-A1),，(t2-t1)=△A,，△t。此方法與終點兩點法的區(qū)別主要有兩點：后一讀數(shù)點反應(yīng)未達(dá)終點,，以速率計算結(jié)果,。它與連續(xù)監(jiān)測法比較，缺點在于人為確定t 1,、t 2,，不定因素較多,，不能保證反應(yīng)在t 1-t 2期間呈線性,，影響結(jié)果準(zhǔn)確性；應(yīng)在常規(guī)測定前,，先做預(yù)試驗來確定線性時間段,。若在選擇的時間段內(nèi)反應(yīng)不成線性(如零級反應(yīng)期短，儀器無法設(shè)置或測定),，則只能改用終點法,。優(yōu)點在于方法簡單；酶活力較低,、測定吸光度值較小時,，可增加測定時間段而不受儀器連續(xù)監(jiān)測時間點的局限，減少讀數(shù)誤差,。
3．速率B法在一個通道內(nèi)一次進(jìn)行兩項反應(yīng)相關(guān)的速率法測定,。它既可以是兩項試驗測定，也可用于干擾或／及樣品空白自動補償0后一用途的原理是：利用儀器的微機自動處理,，在第一反應(yīng)(干擾反應(yīng))一直維持線性的前提下,，可以從第二反應(yīng)(主反應(yīng))速率中扣除第一反應(yīng)速率的延續(xù)影響,。如用于消除膽紅素轉(zhuǎn)化為膽綠素吸光度下降、對肌酐苦味酸法測定的負(fù)干擾等,。某些儀器(如HITACHI系列)設(shè)置此方法,。
(三)空白(blank)校正
在分光光度法中，常利用空白溶液來調(diào)節(jié)儀器的吸光度零點,，或用來抵消某些測定的干擾因素,。在生化分析儀測定中，除了采用雙或多波長,、兩點法等排除背景干擾外,，常要運用專門空白測定，以便從樣品測定吸光度中扣除其影響,。正確選擇空白校正,，對提高準(zhǔn)確度起重要作用。
1．試劑空白一般在方法類型和校準(zhǔn)模式中,，即分為有或無試劑空白兩大類,。試劑空白單獨測定或與校準(zhǔn)配合測定，并需預(yù)選裝載去離子水樣品杯或試劑空白架,。校準(zhǔn)或病人樣品的各測定點吸光度,，均要扣除相應(yīng)測定點的試劑空白吸光度或空白速率值。無試劑空白的方法,，多直接以反應(yīng)杯的水空白作為測定基準(zhǔn)值,。
在不少儀器中，試劑空白測定類似校準(zhǔn)測定,，并非在病人樣品測定時實時測定,。所以，要注意它的測定頻率,，避免因試劑批號或質(zhì)量的變化造成試劑空白的改變引起的計算誤差,。
2.樣品空白 主要為了消除樣品本身混濁或色度的干擾。常采用空白通道法,，測定校正結(jié)果=顯色反應(yīng)通道結(jié)果-空白通道結(jié)果,。多數(shù)儀器須另外占用測定通道，分析速度減半,，但去干擾的準(zhǔn)確性應(yīng)高于兩點終點法,。
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