化學(xué)發(fā)光免疫分析（chemiluminescence immunoassay,CLIA）是將化學(xué)發(fā)光分
析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。這種方法不僅具有化學(xué)發(fā)光分析
的高靈敏度和抗原抗體反應(yīng)的高度特異性,而且還具有分離簡(jiǎn)便特點(diǎn),可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分
析,使之成為醫(yī)學(xué),、生物學(xué)研究領(lǐng)域中一種新的重要的免疫學(xué)分析手段,。
1． 發(fā)光
一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時(shí)，釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射,，稱(chēng)為發(fā)光 (luminescence),。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的激發(fā)能可將發(fā)光分為三種類(lèi)型:光照發(fā)光、生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光,。
1光照發(fā)光(photoluminescence) 發(fā)光劑經(jīng)短波長(zhǎng)入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài),，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時(shí)發(fā)出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見(jiàn)光。
2）生物發(fā)光(bioluminescence) 典型例子為螢火蟲(chóng)發(fā)光,。反應(yīng)底物為螢火蟲(chóng)熒光素 (firefly luciferin),，在熒光素酶(luciferase)的催化下利用ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素 (oxyluciferin),，后者在回復(fù)到基態(tài)時(shí)多余的能量以光子形式放出 3）化學(xué)發(fā)光(Chemiluminescence) 在常溫下經(jīng)化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的發(fā)射光?；瘜W(xué)發(fā)光是一個(gè)多步驟的過(guò)程,，其機(jī)制為某些化合物(發(fā)光劑或發(fā)光底物)可以利用一個(gè)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能量使其產(chǎn)物分子或反應(yīng)中間態(tài)分子上升至電子激發(fā)態(tài)。當(dāng)此產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子衰退至基態(tài)時(shí),，以發(fā)射光子的形式釋放能量(即發(fā)光),。
2．化學(xué)發(fā)光劑
發(fā)光劑是指在發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物，根據(jù)上述發(fā)光特點(diǎn)可將發(fā)光劑分為熒光素,、生物發(fā)光劑和化學(xué)發(fā)光劑三種,。下面主要敘述化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)中常用的化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物,。
1）酶促反應(yīng)的發(fā)光底物 是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類(lèi)發(fā)光底物，目前化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)中常用的酶有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）,。HRP的發(fā)光底物為魯米諾或其衍生物和對(duì)-羥基苯乙酸,。AP的發(fā)光底物為3-（2-螺旋金剛烷-4-甲氧基-4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）和4-甲基傘形酮磷酸鹽（4-MUP,，熒光底物）,。
（1）魯米諾或其衍生物: 魯米諾的氧化反應(yīng)在堿性緩沖液中進(jìn)行,，通常以0.1mol/L pH8.6Tris緩沖液作底物液,。
要注意是:首先,魯米諾和H2O2在無(wú)HRP催化時(shí)也能緩慢自發(fā)發(fā)光，而在最后光強(qiáng)度測(cè)定中造成空白干擾,，因而宜分別配制成2瓶試劑溶液,，只在用前即刻混合;其次, HRP發(fā)光增強(qiáng)劑如某些酚試劑（如鄰－碘酚）或螢火蟲(chóng)熒光素酶可增強(qiáng)HRP催化魯米諾氧化的反應(yīng)和延長(zhǎng)發(fā)光時(shí)間，提高發(fā)光敏感度,。
?。?）對(duì)-羥基苯乙酸（HPA）: 對(duì)-羥基苯乙酸（HPA）在H2O2存在下被HRP氧化或氧化二聚體（熒光物質(zhì)），在350nm激發(fā)光作用下,，發(fā)出450nm波長(zhǎng)的熒光,，可用熒光光度計(jì)測(cè)量。
?。?）AMPPD: AMPPD在堿性條件下,，被ALP酶解生成相當(dāng)穩(wěn)定的AMP-D陰離子，其有2-30min的分解半衰期,，發(fā)出波長(zhǎng)為470nm的持續(xù)性光,，在15min時(shí)其強(qiáng)度達(dá)到高峰，15-60min內(nèi)光強(qiáng)度保持相對(duì)穩(wěn)定,。
?。?）4-MUP: 4-MUP被ALP催化生成4-甲基傘形酮，在360nm的激發(fā)光的作用下,，發(fā)出448nm的熒光,，用熒光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。
2）直接化學(xué)發(fā)光劑 這類(lèi)發(fā)光劑不需酶的催化作用,，只需改變?nèi)芤旱膒H等條件就能發(fā)光的物質(zhì),，如吖啶酯（acridinium, AE）在有過(guò)氧化氫的稀堿溶液中即能發(fā)光。
3）電化學(xué)發(fā)光劑 是指通過(guò)在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光的物質(zhì),?；瘜W(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+（圖16-7）和電子供體三丙胺（TPA）在陽(yáng)性電極表面可同時(shí)失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。二價(jià)的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三價(jià),，成為強(qiáng)氧化劑,，TPA失去電子后被氧化成陽(yáng)離子自由基TPA+,，它很不穩(wěn)定，可自發(fā)地失去一個(gè)質(zhì)子（H+）,，形成自由基TPA.,，成為一種很強(qiáng)的還原劑，可將一個(gè)高能量的電子遞給三價(jià)的[Ru(bpy)3]3+使其形成激發(fā)態(tài)的[Ru(bpy)3]2+.,。激發(fā)態(tài)的三聯(lián)吡啶釕不穩(wěn)定,，很快發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)為620nm的光子，回復(fù)到基態(tài)的三聯(lián)吡啶釕,。這一過(guò)程可在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行,，產(chǎn)生許多光子，使光信號(hào)增強(qiáng),。
