（一）酶標(biāo)記抗體組化法
酶標(biāo)抗體組化技術(shù)是一種綜合定性,、定位和定量，將形態(tài),、機(jī)能和代謝密切結(jié)合為一體的研究和檢測技術(shù),。在原位檢測出病原的同時(shí)，還能觀察到組織病變與該病原的關(guān)系,，確認(rèn)受染細(xì)胞類型,，從而有助于了解疾病的發(fā)病機(jī)理和病理過程。
1,、基本原理
酶標(biāo)抗體技術(shù)是通過共價(jià)鍵將酶連接在抗體上,，制成酶標(biāo)抗體，再借酶對底物的特異催化作用,，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒,，于普通顯微鏡或電鏡下進(jìn)行細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)各種抗原成分的定位，根據(jù)酶標(biāo)記的部位可將其分為直接法（一步法）,、間接法（二步法）,、橋聯(lián)法（多步法）等，用于標(biāo)記的抗體可以是用免疫動(dòng)物制備的多克隆抗體或特異性的單克隆抗體,，最好是特異性強(qiáng)的高效價(jià)的單克隆抗體,。直接法是將酶直接標(biāo)記在第一抗體上，間接法是將酶標(biāo)記在第二抗體上,，檢測組織細(xì)胞內(nèi)的特定抗原物質(zhì),。目前通常選用免疫酶組織化學(xué)間接染色法,。
（1）標(biāo)本的制備和處理
用于酶標(biāo)抗體組化技術(shù)的標(biāo)本有組織切片（冷凍切片和石蠟切片）,、組織壓印片,。標(biāo)本的制作和固定與熒光抗體技術(shù)相同，但尚需要一些特殊處理,。
?。?）標(biāo)記酶
用于標(biāo)記的酶應(yīng)具備以下幾點(diǎn)：
① 酶催化的底物必須是特異的,，且容易被顯示,，所形成的產(chǎn)物易于在光鏡或電鏡下觀察。
?、?所形成的終產(chǎn)物沉淀必須穩(wěn)定,，即終產(chǎn)物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，影響組織學(xué)定位,。
?、?較易獲得的酶分子，最好有商品出售,。
?、?中性 pH 時(shí)，酶應(yīng)穩(wěn)定,，酶標(biāo)記抗體后,，保存 1-2 年活性不應(yīng)改變，且酶的催化活性（ Turnover ）越高越好,。
?、?酶標(biāo)過程中，酶與抗體連接,，不能影響二者的活性,。
⑥ 被檢測組織中,，不應(yīng)存在與標(biāo)記酶相同的內(nèi)源性酶或類似物質(zhì),。
其中 ① 、② 兩點(diǎn)最重要,，因?yàn)槿菀罪@示的酶并非均能形成不可溶性的復(fù)合物,。一般認(rèn)為，辣根過氧化物酶（HRP）較佳,，是最常用的一種酶,。
除 HRP 外，堿性磷酸酶（ALP）和葡萄糖氧化酶（GOD）也較常用。
?。?）底物顯色劑
?、?DAB （3，3-二氨基聯(lián)苯胺）：顯色后陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色,。
?、?AEC （3，氨基-9- 乙基卡巴唑）：顯色后陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈紅色或紫紅色,。
2,、以 PRRSV 為例介紹一下染色程序。
?。?）切片準(zhǔn)備：將低溫保存的切片37 ℃預(yù)熱 5分鐘 ,。
（2）常規(guī)脫蠟： 二甲苯15分鐘,；100% 乙醇 5分鐘,；100%乙醇1分鐘,；90% 乙醇 1分鐘,；75% 乙醇 1分鐘。
?。?）抑制內(nèi)源酶：1% 鹽酸酒精（75% 乙醇 99mL 加 1mL 鹽酸）作用10分鐘,； 3%過氧化氫水溶液作用15分鐘。
?。?）蒸餾水洗 2 次,。
（5）用 0.05% 胰酶37 ℃消化2分鐘,。
?。?）PBS洗2次，擦干周圍后用組化（蠟）筆沿切片周邊畫一個(gè)圈 ,。
?。?）封閉：正常馬血清1：20倍稀釋， 37 ℃ 孵育20分鐘,。
?。?）加一抗（1 : 800倍稀釋的PRRSV單克隆抗體 Mab 15A1），37 ℃孵育1小時(shí)或37 ℃孵育0.5小時(shí)后4 ℃過夜,。對照片不加一抗,。
（9）PBS 洗 3 次,。
?。?0）加二抗（HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 1 : 100X 稀釋）37 ℃孵育1小時(shí)。
?。?1）PBS洗3 次,。
?。?2）加AEC顯色5~10分鐘。
?。?3）蘇木素襯染10秒鐘,。
（14）自來水洗2分鐘,。
?。?5）待切片自然干燥后用水溶性封片劑封片。
?。?6）鏡檢,、觀察記錄結(jié)果。
?。ǘ┢咸亚蚓鞍譇（SPA）免疫檢測技術(shù)
葡萄球菌蛋白A（SPA）是一種從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì),，由于它的一些免疫學(xué)特性，使其成為免疫學(xué)上一種極為有用的工具,。葡萄球菌蛋白A（SPA）免疫檢測技術(shù)是根據(jù)它能與多種動(dòng)物IgG的Fc 端結(jié)合的原理,，用SPA標(biāo)記物（酶、熒光素,、放射性物質(zhì)等）顯示抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的各種免疫檢測實(shí)驗(yàn),。
1、基本原理
SPA 具有和人及多種動(dòng)物如豚鼠,、兔,、豬、犬,、小鼠,、猴等 IgG 結(jié)合的能力，可解決不同動(dòng)物檢測時(shí),，需分別標(biāo)記相對應(yīng)的二抗的問題,。 SPA結(jié)合部位是Fc段，這種結(jié)合不會(huì)影響抗體的活性,。 SPA具有的結(jié)合力是雙價(jià)的,，每個(gè)SPA分子可以同時(shí)結(jié)合兩個(gè)IgG分子，也可一方面同IgG相結(jié)合,，一方面與標(biāo)記物如熒光素,、過氧化物酶、,、膠體金和鐵蛋白等相結(jié)合,。但需注意的是SPA 對 IgG 免疫球蛋白亞型的結(jié)合有選擇性，如SPA與人IgG亞型：IgG 1、IgG 2和IgG 4有結(jié)合力,，唯獨(dú)不結(jié)合IgG 3,。只結(jié)合IgA 2 ，而不結(jié)合 IgA 1,。SPA與禽類血清IgG不結(jié)合,。因此應(yīng)注意可能出現(xiàn)的假陰性結(jié)果。SPA 常用 HRP 標(biāo)記,，可應(yīng)用于間接法,。
2、染色程序
染色程序基本同酶標(biāo)抗體法,，僅二抗改用 SPA-HRP,。
（三） 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判定
1,、對照的設(shè)立
設(shè)立對照的目的在于證明和肯定陽性結(jié)果的特異性,，排除非特異性疑問。主要是針對第一抗體對照,，常用的對照有陽性對照,、陰性對照。
?。?）陽性對照是用已知抗原陽性的切片與待檢標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,，對照切片應(yīng)呈陽性結(jié)果,。證明整個(gè)染色程序符合要求,，尤其當(dāng)待檢標(biāo)本呈陰性結(jié)果時(shí)，陽性對照就更加重要,。
?。?）陰性對照是用確證不含已知抗原的標(biāo)本作對照，應(yīng)呈陰性結(jié)果,，另外空白,、替代、吸收和抑制試驗(yàn)均為陰性對照,。當(dāng)陰性對照成立時(shí),，才能判定檢測結(jié)果，主要用于排除假陽性,。
