引物是如何合成的,？
目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法,。DNA合成儀有很多種, 主要都是由ABI/PE 公司生產(chǎn),，無論采用什么機(jī)器合成,，合成的原理都相同,，主要差別在于合成產(chǎn)率的高低，試劑消耗量的不同和單個循環(huán)用時的多少,。
亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效,、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點(diǎn),。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的,，相鄰的核苷酸通過3'→5'磷酸二酯鍵連接,。
第一步是將預(yù)先連接在固相載體CPG上的活性基團(tuán)被保護(hù)的核苷酸與三氯乙酸反應(yīng)，脫去其5'-羥基的保護(hù)基團(tuán)DMT,，獲得游離的5'-羥基,；
第二步，合成DNA的原料,，亞磷酰胺保護(hù)核苷酸單體,，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體,，它的3'端被活化,，5'-羥基仍然被DMT保護(hù)，與溶液中游離的5'-羥基發(fā)生縮合反應(yīng),。
第三步,，帶帽(capping)反應(yīng)，縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù)5'-羥基沒有參加反應(yīng)(少于2%),，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng),，這種短片段可以在純化時分離掉。
第四步,，在氧化劑碘的作用下,，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。
經(jīng)過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上,。再以三氯乙酸脫去它的5'-羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT,，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去,。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率,。
通過氨水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來,，通過OPC, PAGE等手段純化引物,，成品引物用C18濃縮,脫鹽，沉淀,。沉淀后的引物用水懸浮,，測定OD260定量，根據(jù)定單要求分裝
