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1,、如何計(jì)算提取率,？
1) 回收前樣品中，往往含有非目的DNA 片段,、引物,、dNTP 等，所以不能用測(cè)回收前后吸光度的的方法計(jì)算回收率,；
2) 可將回收前后DNA 片段一起電泳,，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照后，用配套的軟件進(jìn)行電泳條帶灰度對(duì)比,；
3) 注意,，電泳條件及拍攝條件將對(duì)灰度對(duì)比結(jié)果造成很大影響，請(qǐng)仔細(xì)操作,，以減小誤差,。
2、如何簡(jiǎn)易測(cè)算提取率,？
取膠回收后的DNA溶液體積的1/5—1/10,，與等體積的回收前的DNA溶液的5-10倍稀釋液一起電泳，肉眼觀察回收后的條帶相對(duì)于回收前條帶的亮度，粗略測(cè)算回收率（如亮度只有一半時(shí),，其回收率可粗略為50%）,。
3、如何看待提取得率,？
影響回收率的因素很多,，如DNA片段大小、點(diǎn)樣量,、凝膠種類,、電泳緩沖液的緩沖能力、切膠操作,、紫外燈照射強(qiáng)度和時(shí)間,、溶膠是否徹底等等，所以不能單憑1-2次的實(shí)驗(yàn)來判斷其質(zhì)量好壞,，最好是多做幾次實(shí)驗(yàn)或用幾種不同品牌的產(chǎn)品做平行對(duì)照實(shí)驗(yàn),，結(jié)果相對(duì)真實(shí)。
4,、回收率為什么與點(diǎn)樣量和片段大小有關(guān),？
DNA片斷越大，和固相基質(zhì)的結(jié)合力越強(qiáng),，就越難洗脫,，回收率就低；DNA的量越少,，相對(duì)損失越大,，回收率越低。
5,、用膠回收試劑盒從凝膠中回收DNA得率低是什么原因,？
1） 膠塊溶解不完全，可適當(dāng)延長(zhǎng)水浴時(shí)間和上下顛倒的次數(shù)以及增加溶膠液的比例,；
2） 膠塊體積太大,，應(yīng)使用槍頭搗碎，還不能充分溶解則先將其切為小塊,，分多次回收,；
3） 紫外燈下切膠時(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致DNA部分降解,，應(yīng)盡量把切膠時(shí)間控制在30s以內(nèi),；
4） 洗滌液使用后未及時(shí)蓋嚴(yán)瓶蓋，乙醇揮發(fā),，影響回收效率,；
5） TAE或TBE電泳緩沖液不新鮮,，失去了緩沖能力，導(dǎo)致PH值升高,，降低DNA和膜的吸附力,，應(yīng)及時(shí)更換電泳緩沖液，最好使用新鮮配制的電泳緩沖液,，效果更好,；
6） 回收前的樣品量太少，加大點(diǎn)樣量,；
7） 洗脫前,，預(yù)先65℃預(yù)熱洗脫液、延長(zhǎng)室溫靜置時(shí)間,、增加洗脫次數(shù)可以有效提高回收率30%以上。
6,、加入溶膠液溫浴后,，液體仍很粘稠或后續(xù)步驟有堵柱子現(xiàn)象？
1） 膠塊溶解不充分,，可再補(bǔ)加一些溶膠液或延長(zhǎng)水浴時(shí)間并增加上下顛倒次數(shù)幫助溶膠,；
2） 膠塊體積過大，應(yīng)盡量切除多余部分,，并將其切為小碎塊,，分幾次回收；
3） 水浴溫度是否達(dá)到規(guī)定溫度65℃,，用溫度計(jì)檢測(cè),。
7、瓊脂糖凝膠塊不溶,？
1） 瓊脂糖質(zhì)量不好,；
2） 含目的片斷的凝膠在空氣中放置過久，使膠塊失水干躁,，建議切膠后立即進(jìn)行回收或?qū)⒛z塊保存于4 ℃或-20℃,；
3） 制膠的電泳緩沖液濃度過高或陳舊。
8,、點(diǎn)樣時(shí)發(fā)現(xiàn)DNA樣品有漂出點(diǎn)樣孔外的現(xiàn)象,？
柱子上的乙醇未完全揮發(fā)干凈，延長(zhǎng)室溫下空柱靜置時(shí)間以確保乙醇完全揮發(fā)干凈,。
9,、能否使用去離子水洗脫回收？
可以,，但是實(shí)驗(yàn)室所用去離子水一般PH值偏低,，可用NaOH適當(dāng)調(diào)高PH值＞7.0,，以增加回收得率。
10,、能否使用TE（PH8.0）洗脫,？可以。
11,、可否使用小于30μl的洗脫液進(jìn)行洗脫,？
不可以。因?yàn)檎f明書提供的最少洗脫體積是能完全覆蓋吸附膜的最小體積,。
12,、關(guān)于DNA片段大小與回收率的問題？
100bp-500bp,，30-60%,；500bp-4kb，80-95%,；4kb以上,，30-50%。
13,、OD值與瓊脂糖凝膠中的DNA產(chǎn)量不相符,？
從柱子上洗脫下來的痕量雜質(zhì)增加了A260的值。
14,、吸光度純度測(cè)定時(shí)應(yīng)注意哪些問題,？
吸光度測(cè)量的是未知樣品與調(diào)零標(biāo)準(zhǔn)之間的相對(duì)吸光度，所以請(qǐng)用與洗脫液體相同的液體,，對(duì)測(cè)量樣品進(jìn)行稀釋和調(diào)零,。
15、為什么溶膠不徹底會(huì)影響回收結(jié)果的純度,？
在電泳過程中,，DNA會(huì)與大分子的多糖緊密的結(jié)合在一起，凝膠的種類和質(zhì)量不同,，DNA與之結(jié)合力也不同,，只有凝膠充分溶解DNA才能充分釋放，否則,，凝膠將與DNA一起沉淀下來,，洗脫后將影響回收結(jié)果的純度。
